Op Escherichia coli gebaseerde complementatietest om de chaperonnefunctie van heat shock-eiwit te bestuderen 70
Summary
Dit protocol demonstreert de chaperonne-activiteit van heat shock protein 70 (Hsp70). E. coli dnaK756-cellen dienen als model voor de test omdat ze een inheemse, functioneel gehandicapte Hsp70 herbergen, waardoor ze vatbaar zijn voor hittestress. De heterologe introductie van functioneel Hsp70 redt de groeideficiëntie van de cellen.
Abstract
Heat shock protein 70 (Hsp70) is een geconserveerd eiwit dat het vouwen van andere eiwitten in de cel vergemakkelijkt, waardoor het een moleculaire chaperonne wordt. Hoewel Hsp70 niet essentieel is voor de groei van E. coli-cellen onder normale omstandigheden, wordt deze chaperonne onmisbaar voor de groei bij verhoogde temperaturen. Aangezien Hsp70 sterk geconserveerd is, is een manier om de chaperonnefunctie van Hsp70-genen van verschillende soorten te bestuderen, ze heterologisch tot expressie te brengen in E. coli-stammen die ofwel een tekort aan Hsp70 hebben of een native Hsp70 tot expressie brengen die functioneel gecompromitteerd is. E. coli dnaK756-cellen zijn niet in staat om λ bacteriofaag-DNA te ondersteunen. Bovendien vertoont hun oorspronkelijke Hsp70 (DnaK) verhoogde ATPase-activiteit, terwijl het een verminderde affiniteit voor GrpE (Hsp70-nucleotide-uitwisselingsfactor) vertoont. Als gevolg hiervan groeien E. coli dnaK756-cellen adequaat bij temperaturen van 30 °C tot 37 °C, maar sterven ze bij verhoogde temperaturen (>40 °C). Om deze reden dienen deze cellen als model voor het bestuderen van de chaperonne-activiteit van Hsp70. Hier beschrijven we een gedetailleerd protocol voor de toepassing van deze cellen om een complementatietest uit te voeren, waardoor de studie van de in cellulo chaperonnefunctie van Hsp70 mogelijk wordt.
Introduction
Heat shock-eiwitten spelen een belangrijke rol als moleculaire chaperonnes door het vouwen van eiwitten te vergemakkelijken, eiwitaggregatie te voorkomen en hetverkeerd vouwen van eiwitten om te keren1,2. Heat shock proteïne 70 (Hsp70) is een van de meest prominente moleculaire chaperonnes en speelt een centrale rol in eiwithomeostase 3,4. DnaK is de E. coli Hsp70 homoloog5.
Er zijn verschillende biofysische, biochemische en celgebaseerde testen ontwikkeld om de chaperonne-activiteit van Hsp70 te onderzoeken en te screenen op remmers die gericht zijn op deze chaperonne 6,7,8. Hsp70 is een sterk geconserveerd eiwit. Om deze reden zijn verschillende Hsp70’s van eukaryote organismen, zoals Plasmodium falciparum (de belangrijkste verwekker van malaria), gemeld om de DnaK-functie in E. coli 6,9 te vervangen. Op deze manier is een op E. coli gebaseerde complementatietest ontwikkeld met betrekking tot de heterologe expressie van Hsp70’s in E. coli om hun cytoprotectieve functie te onderzoeken. Meestal omvat deze test het gebruik van E. coli-cellen die ofwel een tekort hebben aan DnaK of die een native DnaK tot expressie brengen die functioneel gecompromitteerd is. Hoewel DnaK onder normale omstandigheden niet essentieel is voor de groei van E. coli, wordt het essentieel wanneer de cellen worden gekweekt onder stressvolle omstandigheden zoals verhoogde temperaturen of andere vormen vanstress10,11.
E. coli-stammen die zijn ontwikkeld om de functie van Hsp70 te bestuderen met behulp van een complementatietest zijn onder meer E. coli dnaK103 (BB2393 [C600 dnaK103(Am) thr::Tn10]) en E. coli dnaK756. E. coli dnaK103-cellen produceren een afgeknotte DnaK die niet functioneel is, en als zodanig groeien de cellen voldoende bij 30 °C, terwijl de stam gevoelig is voor koude- en hittestress 12,13. Ook de E. coli dnaK756/BB2362 (dnaK756 recA::TcR Pdm1,1) stam wordt niet hoger dan 40 °C14,15. De E. coli dnaK756-stam brengt een gemuteerd native DnaK (DnaK756) tot expressie dat wordt gekenmerkt door drie glycine-naar-aspartaatsubstituties op posities 32, 455 en 468, wat aanleiding geeft tot gecompromitteerde proteostatische uitkomsten. Bijgevolg is deze stam resistent tegen bacteriofaag λ DNA14. Bovendien vertoont E. coli dnaK756 een verhoogde ATPase-activiteit, terwijl de affiniteit voor de nucleotide-uitwisselingsfactor, GrpE, verminderd is16. E. coli DnaK-mutante stammen dienen als ideale modellen voor het onderzoeken van de chaperonne-activiteit van Hsp70 door middel van een complementatiebenadering. Aangezien DnaK alleen essentieel is onder stressvolle omstandigheden, wordt de complementatietest meestal uitgevoerd bij verhoogde temperaturen (Figuur 1). Enkele voordelen van het gebruik van E. coli voor dit onderzoek zijn het goed gekarakteriseerde genoom, de snelle groei en de lage kosten van kweek enonderhoud17.
In dit artikel beschrijven we in detail een protocol waarbij E. coli dnaK756-cellen worden gebruikt om de functie van Hsp70 te bestuderen. De Hsp70’s die we in de test hebben gebruikt, zijn wild-type DnaK en zijn chimere derivaat, KPf (bestaande uit het ATPase-domein van DnaK dat is gefuseerd met het C-terminale substraatbindende domein van Plasmodium falciparum Hsp70-1 6,18). KPf-V436F werd heteroloog uitgedrukt als een negatieve controle, aangezien de mutatie in wezen blokkeert om substraten te binden, waardoor de chaperonne-activiteit wordt opgeheven9.
Protocol
Representative Results
Discussion
Het protocol demonstreert het nut van E. coli dnaK756-cellenbij het onderzoeken van de chaperonnefunctie van heterologisch tot expressie gebracht Hsp70. Deze test zou kunnen worden gebruikt om remmers te screenen die gericht zijn op de Hsp70-functie in cellulo. Een beperking van deze methode is echter dat Hsp70’s die niet in staat zijn om DnaK in E. coli te vervangen, niet compatibel zijn met deze test. Gebrek aan posttranslationele modificatie21 van sommige niet-inheems…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Het werk werd ondersteund met subsidie verkregen van het International Centre for Genetic Engineering and Biotechnology (ICGEB) subsidienummer, HDI/CRP/012, Research Directorate van de Universiteit van Venda, grant I595, Department of Science and Innovation (DSI) en de National Research Foundation (NRF) van Zuid-Afrika (subsidienummers, 75464 en 92598) toegekend aan AS.
Materials
| 2-β-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | 8,05,740 | Constituent for sample loading dye |
| Acetic acid | Labchem | 101005125 | Constituent of destainer |
| Acrylamide | Sigma-Aldrich | 8008300100 | Component of SDS |
| Agar | Merck | HG000BX1.500 | Constituent of medium and liquid growth assay |
| Agarose | Clever Scientific | 14131031 | Certified molecular biology agarose |
| Ammonium persulfate | Sigma-Aldrich | 101875295 | Constituent for SDS-PAGE gel |
| Ampicillin | VWR International | 0339—EU—25G | Selective antibiotic |
| Bis | Sigma-aldrich | 1015460100 | Component of SDS |
| Bromophenol | Sigma-Aldrich | 0449-25G | Constituent for sample loading dye |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | 10043-52-4 | For competent cells preparation |
| Coomassie brilliant blue | VWR International | 443293X | SDS-PAGE dye |
| Dibasic sodium phosphate | Sigma-Aldrich | RB10368 | Constituent of PBS buffer |
| ECL | Thermofischer Scientific | 32109 | Western blot detection reagent |
| Ethidium Bromide | Thermofischer Scientific | 17898 | DNA intercalating dye |
| Glycerol | Merck | SAAR2676520L | Constituent for sample loading dye |
| Glycine | VWR International | 10119CU | Component of SDS |
| IPTG | Glentham life sciences | 162IL | inducer |
| Kanamycin | Melford | K0126 | Selective antibiotic |
| Magnesium Chloride | Merck | SAAR4123000EM | Constituent of medium and liquid growth assay |
| Methanol | Labchem | 113140129 | Constituent of destainer |
| Monobasic potassium phosphate | Merck | 1,04,87,30,250 | Constituent of PBS buffer |
| Peptone | Merck | HG000BX4.250 | Constituent of medium and liquid growth assay |
| Potassium chloride | Merck | SAAR5042020EM | Constituent of PBS buffer |
| PVDF membrane | Thermofischer scientific | PB7320 | Western blot membrane |
| Sodium Chloride | Merck | SAAR5822320EM | Constituent of medium and liquid growth assay |
| Sodium dodecyl sulphate | VWR International | 108073 | To resolve expressed proteins |
| Spectramax iD3 | Separations | 373705019 | Automated plate reader |
| TEMED | VWR international | ACRO420580500 | Component of SDS gel |
| Tetracycline | Duchefa Biochemies | T0150.0025 | Selective antibiotic |
| Tris | VWR International | 19A094101 | Component of SDS gel |
| Tween20 | Merck | SAAR3164500XF | Constituent for Western wash buffer |
| Western transfer chamber | Thermofisher Scientific | PB0112 | Transfer of protein to nitrocellulose membrane |
| Yeast extract | Merck | HG000BX6.500 | Constituent of medium and liquid growth assay |
| α-DnaK antibody | Inqaba | BK CAC09317 | Primary antibody |
| α-rabbit antibody | Thermofischer scientific | 31460 | Secondary antibody |
References
- Bukau, B., Deuerling, E., Pfund, C., Craig, E. A. Getting newly synthesized proteins into shape. Cell. 101 (2), 119-122 (2000).
- Shonhai, A. Plasmodial heat shock proteins: targets for chemotherapy. FEMS Microbiol. Immunol. 58 (1), 61-74 (2010).
- Mogk, A., et al. Identification of thermolabile Escherichia coli proteins: prevention and reversion of aggregation by DnaK and ClpB. EMBO J. 18 (24), 6934-6949 (1999).
- Edkins, A. L., Boshoff, A., Shonhai, A., Picard, D., Blatch, G. L. General structural and functional features of molecular chaperones. Heat shock proteins of malaria. Adv Exp Med Biol. , (2021).
- Bertelsen, E. B., Chang, L., Gestwicki, J. E., Zuiderweg, E. R. Solution conformation of wild-type E. coli. Hsp70 (DnaK) chaperone complexed with ADP and substrate. PNAS. 106 (21), 8471-8476 (2009).
- Shonhai, A., Boshoff, A., Blatch, G. L. Plasmodium falciparum heat shock protein 70 is able to suppress the thermosensitivity of an Escherichia coli DnaK mutant strain. Mol Genet Genomics. 274, 70-78 (2005).
- Shonhai, A., Botha, M., de Beer, T. A., Boshoff, A., Blatch, G. L. Structure-function study of a Plasmodium falciparum Hsp70 using three-dimensional modelling and in vitro analyses. Protein Pept Lett. 15 (10), 1117-1125 (2008).
- Cockburn, I. L., Boshoff, A., Pesce, E. -. R., Blatch, G. L. Selective modulation of plasmodial Hsp70s by small molecules with antimalarial activity. Biol Chem. 395 (11), 1353-1362 (2014).
- Makhoba, X. H., et al. Use of a chimeric Hsp70 to enhance the quality of recombinant Plasmodium falciparum s-adenosylmethionine decarboxylase protein produced in Escherichia coli. PLoS One. 11 (3), 0152626 (2016).
- Bukau, B., Walker, G. C. Cellular defects caused by deletion of the Escherichia coli dnaK gene indicate roles for heat shock protein in normal metabolism. J Bact. 171 (5), 2337-2346 (1989).
- Makumire, S., Revaprasadu, N., Shonhai, A. DnaK protein alleviates toxicity induced by citrate-coated gold nanoparticles in Escherichia coli. PLoS One. 10 (4), 0121243 (2015).
- Spence, J., Cegielska, A., Georgopoulos, C. Role of Escherichia coli heat shock proteins DnaK and HtpG (C62. 5) in response to nutritional deprivation. J Bact. 172 (12), 7157-7166 (1990).
- Mayer, M. P., et al. Multistep mechanism of substrate binding determines chaperone activity of Hsp70. Nat Struct Biol. 7 (7), 586-593 (2000).
- Georgopoulos, C. A new bacterial gene (groP C) which affects λ DNA replication. Mol Genet Genomics. 151 (1), 35-39 (1977).
- Tilly, K., McKittrick, N., Zylicz, M., Georgopoulos, C. The dnaK protein modulates the heat-shock response of Escherichia coli. Cell. 34 (2), 641-646 (1983).
- Buchberger, A., Gassler, C. S., Buttner, M., McMacken, R., Bukau, B. Functional defects of the DnaK756 mutant chaperone of Escherichia coli indicate distinct roles for amino-and carboxyl-terminal residues in substrate and co-chaperone interaction and interdomain communication. J Biol Chem. 274 (53), 38017-38026 (1999).
- Taj, M. K., et al. Escherichia coli as a model organism. Int J Eng Res. 3 (2), 1-8 (2014).
- Sato, S., Wilson, R. I. Organelle-specific cochaperonins in apicomplexan parasites. Mol Biochem Parasitol. 141 (2), 133-143 (2005).
- Molecular characterisation of the chaperone properties of Plasmodium falciparum. heat shock protein 70. Rhodes University Available from: https://commons.ru.ac.za/vital/access/manager/Repository/vital:3977?site_name=Rhodes+University (2007)
- Makumire, S., et al. Mutation of GGMP repeat segments of Plasmodium falciparum Hsp70-1 compromises chaperone function and Hop co-chaperone binding. Int J Mol Sci. 22 (4), 2226 (2021).
- Nitika, P. C. M., Truman, A. W., Truttmann, M. C. Post-translational modifications of Hsp70 family proteins: Expanding the chaperone code. J Biol Chem. 295 (31), 10689-10708 (2020).
- Knighton, L. E., Saa, L. P., Reitzel, A. M., Truman, A. W. Analyzing the functionality of non-native Hsp70 proteins in Saccharomyces cerevisiae. Bio Protoc. 9 (19), e3389 (2019).
