Summary
Betydningen af petite kolonier i Candida spp. lægemiddelresistens er ikke blevet undersøgt fuldt ud. Antimikrobiel fotodynamisk terapi (aPDT) tilbyder en lovende strategi mod lægemiddelresistente svampeinfektioner. Denne undersøgelse viser, at rose bengal-medieret aPDT effektivt deaktiverer Candida glabrata og inducerer petite kolonier, hvilket præsenterer en unik procedure.
Abstract
Med en dødelighed på 40% hos candidæmipatienter er lægemiddelresistente Candida og deres små mutanter fortsat en stor behandlingsudfordring. Antimikrobiel fotodynamisk terapi (aPDT) er rettet mod flere svampestrukturer, i modsætning til antibiotika / svampemidler, hvilket potentielt modvirker resistens. Traditionelle metoder til inducering af petite kolonier er afhængige af ethidiumbromid eller fluconazol, som kan påvirke lægemiddelfølsomhed og stressresponser. Denne undersøgelse undersøgte anvendelsen af grønt lys (peak 520 nm) og rose bengal (RB) fotosensibilisator til bekæmpelse af et lægemiddelresistent Candida glabrata-isolat . Resultaterne afslørede, at aPDT-behandling signifikant hæmmede cellevækst (≥99,9% reduktion) og effektivt inducerede dannelse af petite koloni, hvilket fremgår af reduceret størrelse og tab af mitokondriel redoxindikatorfarvning. Denne undersøgelse giver indledende bevis for, at aPDT kan inducere petite kolonier i en multiresistent C. glabrata stamme in vitro, hvilket giver en potentielt transformativ tilgang til bekæmpelse af resistente svampeinfektioner.
Introduction
Svampeinfektioner, især dem, der forårsages af Candida albicans og stadig mere lægemiddelresistente Candida glabrata, udgør en alvorlig global trussel1. Disse infektioner kan være dødelige, især for indlagte patienter og dem med svækket immunsystem. Stigende svampedræbende resistens truer kontrollen med invasiv candidiasis, en alvorlig svampeinfektion med høj dødelighed, især fra Candida albicans2. Resistente stammer hindrer effektiv behandling, hvilket potentielt øger både kompleksitet og dødelighed. I Alameda County, Californien, USA, er C. glabrata blevet den mest udbredte invasive art3. Dette skift i forekomsten og fordelingen af Candida-arter kan påvirkes af lokal sundhedspraksis, patientdemografi, brugen af svampedræbende midler og forekomsten af risikofaktorer for Candida-infektioner.
Små mutanter i Candida, der mangler funktionelle mitokondrier, afslører, hvordan denne organel påvirker lægemiddelrespons, virulens og stressresistens 4,5. C. glabrata danner let disse kolonier og får følsomhed over for polyener, mens den mister den til azoler6. Azolfølsomhed og åndedrætsfunktion er tæt forbundet, med nedsat åndedræt, der fører til resistens via mitokondrielt DNA-tab7. Små kolonier af C. glabrata med azolresistens er blevet isoleret fra humane afføringsprøver fra en knoglemarvstransplanteret modtager, der gennemgår fluconazolbehandling8, og fra bloddyrkningsflasker fra patienter med blodbaneinfektioner9. Deres potentielle implikationer i lægemiddelresistens, virulens og stressrespons fremhæver deres kliniske betydning. Derudover gør deres forskellige egenskaber dem til værdifulde værktøjer til at undersøge grundlæggende spørgsmål i mitokondriebiologi5. Efterhånden som forskningen i små mutanter fortsætter, vil deres anvendelser i både klinisk forskning og grundforskning sandsynligvis udvides.
Denne undersøgelse opdagede, at fotodynamisk terapi (PDT) kan fremkalde små kolonier i C. glabrata, hvilket udvider rækken af metoder ud over de traditionelle teknikker til at udsætte C. glabrata for ethidiumbromid eller fluconazol.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Dyrkning af C. glabrata
BEMÆRK: En multiresistent C. glabrata (C2-1000907), der er resistent over for de fleste svampedræbende midler, herunder fluconazol, anvendes til forsøgene. Det kan være nødvendigt at tilpasse forsøgsbetingelserne til den specifikke stamme, da der kan forekomme variationer mellem forskellige stammer. Alle eksperimenter brugte log-fase Candida dyrket ved 25 ° C (efterligner naturlig infektion) for konsistens. C. glabratas mangel på hyfer forenkler kvantificeringen sammenlignet med C. albicans, som danner hyfer ved 37 °C10.
- For at forberede en logfasekultur af C. glabrata skal du vælge en enkelt koloni fra en agarplade og overføre den til et glasreagensglas med 3 ml sterilt gærpeptondextrose (YPD) medium (se materialetabel). Der inkuberes i 14-16 timer ved 25 °C under omrystning (155 omdr./min., 45° vinkel for at øge luftoverførslen til mediet).
- Efter inkubation fortyndes kulturen med frisk YPD til en OD600 på 0,1 ved hjælp af steril teknik. Der inkuberes ved 25 °C i 6 timer under omrystning ved 155 o/min. Logfasen af C. glabrata kontrolleres ved at måle OD600. Sigt efter 0,65-1,00, hvilket svarer til 1 × 10 7-1,5 × 107 celler/ml.
2. Induktion af petite kolonier med ethidiumbromid, fluconazol og fotodynamisk terapi
- Ethidiumbromid petite koloni induktion
- Juster en gærsuspension til en OD600 på 0,1 (5 × 106 celler / ml) med YPD til et slutvolumen på 3 ml, tilsæt derefter 30 μL ethidiumbromidstamme (10 mg / ml) (se materialetabel) for en endelig koncentration på 100 μg / ml.
- Gærsuspensionen inkuberes natten over (16-18 timer) ved 25 °C, 155 o/min, 45° vinkel. Juster til en OD600 på 0,65 (1 × 107 celler / ml). Der udføres en 10 gange fortyndingsserie i en plade med 96 huller ved at tilsætte 20 μL af den justerede gærsuspension til 180 μL PBS pr. hul. Dette skaber seks fortyndinger fra 10-1 til 10-5.
- Vælg 4 fortyndingsfaktorer (f.eks. 100, 101, 102 og 103) og plade 3 dråber (20 μL) hver på 4 kvadranter af YPD-agarplader (tredobbelt).
- Pladerne inkuberes natten over ved 37 °C. Vælg kvadranter med 5-80 kolonier fra de tidligere valgte fortyndinger for triphenyltetrazoliumchloridfarvning (TTC)11 (se trin 3). Scan plader ved 1200 dpi ved hjælp af en 48-bit optisk farvescanner.
- Fluconazol petite koloni induktion
BEMÆRK: For at fremskynde processen skal du bruge T3-celler (en blanding af normale og petite celler opnået efter 3 RB-PDT-behandlinger; se trin 2.3) til fluconazol-induceret petite kolonidannelse. Dette skyldes, at standardbehandling typisk resulterer i langsommere dannelse.- Der fremstilles og justeres en gærcellesuspension som beskrevet i trin 2.1.1.
- Der inkuberes natten over (16-18 timer) ved 25 °C. Juster OD600 til 0,1 igen.
- Overfør 1 ml af den justerede suspension til et sterilt 5 ml rør.
- Dyp en steril vatpind (15 cm lang, med en 0,9 cm x 2,6 cm spids, se materialetabel) i gærsuspensionen, sørg for kontakt med rørbunden og vrid for at fjerne overskydende væske fra rørvæggen.
- Forbered pladerne i emhætten ved hjælp af Mueller-Hinton agar (se materialetabel).
- Svab bomulden frem og tilbage på agaren, drej 60 ° to gange, og tør derefter omkredsen for jævn dækning.
- Steriliser tang over en flamme i 1-2 s, så de kan afkøle kort, og brug dem derefter til at hente de tomme diske.
- Opdel pladen i tre lige store sektorer ved hjælp af en markør. Placer en tom disk i midten af hver sektor.
- Der tilsættes 12,5 μL fluconazol (2 mg/ml, se materialetabellen) til hver disk (25 μg/disk), blandes grundigt for at undgå bobler og inkuberes ved 37 °C i 20-24 timer.
- Udfør TTC-farvningen (se trin 3). Scan plader ved 1200 dpi ved hjælp af en 48-bit optisk farvescanner.
- PDT petite koloni induktion
BEMÆRK: Forskellige svampe kan producere forskellige antal petite kolonier efter PDT. Nogle stammer producerer muligvis slet ingen.- Forbered aPDT-systemet.
BEMÆRK: Opsætningsproceduren for aPDT-systemenheden følger metoden rapporteret af Hung et al12. Kort fortalt består aPDT-systemet af et grønt LED-array med en top ved 520 nm (se materialetabel), der skinner lys fra bunden med god justering med hver brønd på en 96-brøndplade. - Gærcellesuspensionen i YPD-mediet justeres til en OD600 på 0,65 (ca. 1 × 107 celler / ml).
- Bland 1 ml gærsuspension med 111 μL 2% rosenbengal (RB, figur 1) (se materialetabel) i et rør med rund kappe for at give en endelig RB-koncentration på 0,2%. Blandingen inkuberes ved 25 °C i 15 minutter, roteres i en vinkel på 45° ved 155 omdr./min.
- Overfør blandingen til et 1,5 ml mikrocentrifugeglas og centrifuger ved 16.100 x g i 2,5 minutter (ved stuetemperatur).
- Kassér supernatanten og skrab forsigtigt tuben fem gange på hættens gulv for at genopslæmme pillen.
- Vask suspensionen med 1x PBS fire gange for at fjerne al RB. Hver vask efterfølges af resuspension af pelleten med kort hvirvelstrøm eller pipettering til grundig resuspension.
- Efter den sidste vask tilsættes 1000 μL PBS. Opløsningen er lyserød i farven. Der overføres 200 μL af den vaskede RB-fyldte gærsuspension til hver af tre brønde i en plade med 96 brønde (tre gange).
- Placer 96-brøndspladen på det fotodynamiske lyssystem med LED-pærer, der skinner grønt lys nedefra. Sluk lyset i rummet for at sikre ensartet belysning og forhindre interferens. Aktivér LED-lyssystemet for at levere PDT-dosis på 4,38 J/cm2 over 2 min; Sørg for, at systemet er korrekt justeret med brøndene.
- Efter bestråling fortyndes gærsuspensionen i en plade med 96 brønde. Tilsæt 20 μL gærsuspension til en brønd indeholdende 180 μL PBS, hvilket skaber en 10 gange fortynding. Gentag for de resterende fortyndinger for at opnå et interval på 10-1 til 10-5.
- Vælg fire fortyndingsfaktorer (f.eks. 10-2 til 10-5) baseret på gærcellekoncentrationsjusteringen.
- For hver fortyndingsfaktor plade 3 dråber (20 μL hver) pr. kvadrant på YPD-agarplader.
- Når gærsuspensionen er fuldstændigt absorberet, vendes og inkuberes ca. 10 minutter af agarpladerne natten over ved 37 °C.
- Definer T0 som kontrolforældrenes C. glabrata uden PDT-behandling. Forbered T0-svampe i logvækstfasen som beskrevet ovenfor og udsæt dem for 4,38 J /cm 2 grønt lys i nærværelse af 0,2% RB. Denne PDT-tilstand hæmmer konsekvent 3 til 3,5 logfiler af svampevækst.
- Angiv de overlevende svampe som T1 og udsæt dem for den samme PDT-dosis igen, efter at de er udvidet in vitro til en logvækstfase. De overlevende svampe efter den anden PDT betegnes som T2 og så videre.
- Den næste dag skal du vælge kvadranter med kolonitællinger mellem 5 og 80. Tæl antallet af kolonier i hver kvadrant, og beregn titeren med følgende formel: Kolonidannende enhed (CFU)/ml = Antal kolonier (gennemsnit af tredobbelt) × Fortyndingsfaktor × 50.
- Udfør TTC-farvningen (se trin 3). Scan pladen som beskrevet tidligere (trin 2.2).
- Forbered aPDT-systemet.
3. Mitokondriefunktionsanalyse (TCC-farvningstest)
BEMÆRK: TTC er en redoxindikator og en elektronacceptor. Det bliver rødt, når hvide forbindelser brydes af elektroner11. Bemærk, at ikke alle celler nødvendigvis danner synlige kolonier inden for 24 timer efter dyrkning på en agarplade. Kolonier med funktionelle mitokondrier bliver røde, mens de med ikke-funktionelle mitokondrier forbliver hvide. Dette muliggør differentiering mellem kolonier med forskellig mitokondriefunktionalitet.
- Efter behandling fortyndes Candida-suspensioner på YPD-agarplader i henhold til den ønskede celletæthed for at opnå forskellige kolonier for nem visualisering og farvning.
- Efter 24 timers vækst ved 37 °C dannes synlige kolonier fra en enkelt celle. Pipette 20 μL 20% TTC direkte på midten af hver koloni.
- Efter fuldstændig absorption, ca. 10 min TTC af kolonierne, inkuberes ved 37 ° C i 30-40 minutter.
4. Vækstkinetik af normal og petite C. glabrata
BEMÆRK: Tre gærstammer blev sammenlignet: C. glabrata C2-1000907 T0 (klinisk isolat uden PDT-behandling), T3n (C. glabrata C2-1000907 efter 3 på hinanden følgende RB-PDT-kolonier, der udviser kolonier med en gennemsnitlig diameter på 1,5 ± 0,8 mm svarende til forældrecellerne) og T3p (petite kolonier af C. glabrata C2-1000907 efter 3 på hinanden følgende RB-PDT).
- Gærcellesuspensionen justeres i YPD-medium til en OD600 på 0,1 (5 × 106 celler / ml) i et 3 ml rør.
- Mål automatisk OD600 for den statiske kultur hvert 20. minut ved hjælp af multi-mode mikropladelæseren (se materialetabellen) i 24 timer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Dataene præsenteres som gennemsnittet med ± standardfejl og blev opnået fra tre uafhængige eksperimenter med mindst tre eksemplarer i hver gruppe. Eksperimentelle data, herunder kolonitællinger, OD600-målinger og TTC-farvningsresultater, blev graferet og statistisk analyseret ved hjælp af graftegning og statistisk software (se materialetabel). Envejs ANOVA eller t-test blev brugt til at analysere dataene, og en p-værdi <0,05 blev betragtet som signifikant. Scanning blev udført med en 48-bit fuldfarve optisk scanner med en opløsning på 1200 dpi, og efterfølgende målinger af kolonidiametrene blev udført ved hjælp af ImageJ-software.
Som vist på vækstkurverne i figur 2 udviste petite mutanter af C. glabrata C2-1000907 (T3p) langsommere vækst sammenlignet med de ubehandlede forældresvampe af normal størrelse (T0). Når C. glabrata blev blandet med 0,2% RB i 15 minutter og udsat for 4,38 J/cm2 grønt lys (PDT-behandling), faldt svampens titer fra 107,5 CFU/ml til 104,5 CFU/ml (mindst 3 logfiler, figur 3) sammenlignet med kontrolgruppen (kun RB), som havde en celletæthed på ca. 107 CFU/ml. Derudover blev der efter aPDT'er observeret petite kolonier. Disse små kolonier havde en gennemsnitlig størrelse på 0,4 mm ± 0,25 mm i stedet for den sædvanlige størrelse på 1,5 mm ± 0,8 mm (figur 4A). Små kolonier med mitokondriel dysfunktion kan identificeres ved deres størrelse og farve efter farvning med 20% TTC. De små kolonier, der opretholdt en hvid farve (figur 3B, hvide pile) udviste mitokondriel dysfunktion, mens nogle mindre rødfarvede kolonier og kolonier af normal størrelse bevarede normal mitokondriefunktion (figur 4B). Det traditionelle DNA-interkaleringsmiddel ethidiumbromid (figur 4C) og fluconazol (figur 4D) kan effektivt inducere små mutanter af Candida. Diskdiffusion er en simpel metode til at definere lægemiddelfølsomhed i svampe. I figur 4D omgav en klar cirkulær zone uden vækst fluconazolskiven indeholdende 25 μg fluconazol i T0-kulturen (uden PDT), hvilket indikerer mindre lægemiddelresistens i denne forældresvamp. Ikke desto mindre defineres C. glabrata C2-1000907 stadig som en resistent stamme ved minimal hæmningskoncentration over for fluconazol (data ikke vist) og diameteren af den klare zone. I T3-kulturen dannede mange små kolonier nær disken (pil, nederste panel), hvilket tyder på lægemiddelresistens efter tre gentagne PDT-behandlinger.
Figur 1: Molekylstruktur af rose Bengal (RB). Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Vækstkurver for C. glabrata C2-1000907 24 timer efter gentagen RB-PDT. Vækstkurver blev sammenlignet for tre stammer: C. glabrata C2-1000907 T0 (naive forældreceller), T3n (kolonier med normal størrelse efter 3 gentagne behandlinger) og T3p (petite kolonier efter 3 gentagne behandlinger). Sammenlignet med T0 og T3n udviste T3p-kolonier en signifikant langsommere vækstrate (n = 3, p < 0,05). Alle celler dyrkes i YPD-medium. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Væksthæmning af C. glabrata C2-1000907 efter aPDT. En enkelt aPDT-behandling med en 4,38 J/cm² let dosis og 0,2% RB hæmmede signifikant C. glabrata C2-1000907-væksten med 3 logfiler sammenlignet med den naive kontrol (p < 0,0001, uparret t-test). Fejlbjælker repræsenterer gennemsnit ± SEM, data samles fra 3 uafhængige eksperimenter. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: Mitokondriel dysfunktionsanalyse ved hjælp af triphenyltetrazoliumchlorid (TCC) farvning. (A) C. glabrata C2-1000907, 24 timer efter aPDT-behandling (0,2% RB, 4,38 J/cm² grønt lys), viste en bimodal kolonistørrelsesfordeling med store (1,5 mm ± 0,8 mm) og små (små) kolonier (0,4 mm ± 0,25 mm). (B) TCC-farvning afslørede, at de store kolonier var funktionelle, da de blev røde, mens de små kolonier ikke var funktionelle, da de forblev hvide. (C) Små kolonier blev også induceret af ethidiumbromid (100 μg/ml i 30-40 minutter) og (D) fluconazol (25 μg/ml) behandling. En klar cirkulær zone uden vækst omgav fluconazolskiven indeholdende 25 μg fluconazol i T0-kulturen (uden PDT), hvilket indikerer modtagelighed. I T3-kulturen dannede mange små kolonier nær disken (pil, nederste panel), hvilket tyder på lægemiddelresistens efter tre gentagne PDT-behandlinger. Vægtstænger: 1 mm. Klik her for at se en større version af denne figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne undersøgelse afslører PDT som den første rapporterede metode til at inducere dannelse af petite kolonier i Candida, hvilket overgår de etablerede virkninger af ethidiumbromid og fluconazol. Denne nye observation kræver yderligere udforskning for at opklare dens konsekvenser for både svampeudryddelse ved faldende virulens og fremkomsten af resistensmekanismer.
RB-medieret PDT hæmmer effektivt væksten af C. glabrata, hvilket tyder på en potentiel alternativ behandlingsmetode for Candida-infektioner. Som en lysaktiveret fotosensibilisator producerer RB singlet oxygen og reaktive iltarter (ROS), når de udsættes for en bestemt bølgelængde. Denne oxidative stress forårsager skade på essentielle cellulære komponenter såsom lipider, proteiner og nukleinsyrer13, hvilket fører til mitokondriel dysfunktion, som vist i denne undersøgelse. Dette gør det vanskeligt for Candida at udvikle resistens gennem konventionelle mekanismer observeret med standard svampedræbende stoffer.
De tre gærstammer, der anvendes i denne undersøgelse, T0, T3n og T3p, udviser forskellige vækstmønstre. T0 forbliver ubehandlet, mens T3n og T3p gennemgår RB-PDT tre gange. T3n viser kolonier af normal størrelse, mens T3p udviser små kolonier. Den langsommere vækst af de små kolonier kan indikere ændringer i cellulær energi og metabolisme. Den lille fænotype, ofte forbundet med mitokondriel dysfunktion4, kan føre til nedsat aerob respiration og følgelig påvirke den samlede vækstkinetik. Den nedsatte aerobe respiration i små kolonier kan påvirke deres virulens, lægemiddelmodtagelighed eller evne til at fortsætte i forskellige miljøer. Denne forbindelse har potentielle kliniske implikationer og giver muligheder for fremtidige forskningsretninger.
Ethidiumbromid, et DNA-interkaleringsmiddel, hæmmer mitokondrie-DNA-syntese og nedbryder eksisterende mitokondrie-DNA og omdanner Candida til små kolonier med mitokondriel dysfunktion14. Fluconazol, der almindeligvis anvendes til behandling af Candida-infektioner, kan fremkalde lægemiddelresistens og udvikling af petite colony i C. glabrata6. Små mutanter kan udvise azolresistens gennem aktivering af transkriptionsfaktoren PDR1 og dens regulering af generne CDR1 og CDR215. På grund af det delvise eller fuldstændige tab af mitokondrie-DNA kompromitteres mitokondriefunktionendesuden 16.
PDT har vist sig effektiv til at reducere bakteriel virulens17, inducere modtagelighed for antibiotika18 og reducere biofilmdannelse19 i bakterier. Undersøgelser af PDT mod svampeinfektioner er begrænsede20. Denne opdagelse rejser spændende spørgsmål om, hvordan RB-PDT påvirker mitokondrier i C. glabrata. For fuldt ud at forstå, hvordan RB-PDT påvirker gærceller, er det afgørende at forstå de molekylære mekanismer, der forårsager vækstvariationer. Imidlertid er små mutanter induceret af PDT i øjeblikket underundersøgt, og deres detaljerede mekanistiske grundlag forbliver uklart. Yderligere undersøgelse er nødvendig for at afgøre, om der er forskelle mellem små kolonier skabt ved forskellige metoder. At forstå, hvordan petites dannes i Candida-arter, er vigtigt for at studere forholdet mellem mitokondriefunktion og patogenicitet. Desuden kan petite mutanter tjene som en model for at udforske antifungale lægemiddelresistensmekanismer.
Den nuværende undersøgelse giver værdifuld indsigt i virkningerne af RB-medieret PDT på C. glabrata og fremkomsten af petite kolonier, men har visse begrænsninger, der bør overvejes. For det første fokuserede undersøgelsen primært på in vitro-forsøg, og oversættelsen af disse resultater til kliniske indstillinger berettiger yderligere undersøgelse. Derudover kræver de specifikke molekylære mekanismer, der ligger til grund for dannelsen af petite kolonier efter RB-PDT og deres potentielle konsekvenser for svampedræbende lægemiddelresistens, mere dybtgående udforskning. Desuden, mens undersøgelsen sammenlignede vækstmønstrene for forskellige gærstammer, kunne yderligere molekylære og genetiske analyser give en dybere forståelse af de metaboliske og genetiske ændringer forbundet med dannelse af petite kolonier.
Desuden blev den potentielle variabilitet i respons på RB-PDT blandt forskellige kliniske isolater af C. glabrata ikke behandlet i dette studie, hvilket understreger behovet for bredere stammespecifikke undersøgelser. Fremtidige undersøgelser, der adresserer disse begrænsninger, vil være afgørende for en mere omfattende forståelse af konsekvenserne af RB-medieret PDT og fremkomsten af petite kolonier i forbindelse med svampedræbende behandlingsstrategier.
Sammenfattende afslører denne undersøgelse, at aPDT inducerer C. glabrata (C2-1000907) små mutanter med nedsat mitokondriefunktion. Denne unikke mekanisme kan tilbyde en ny metode til svampedræbende undersøgelser. Den præcise virkningsmekanisme, der ligger til grund for PDT-inducerede petite kolonier, mangler stadig at blive belyst, og udforskning af potentielle forskelle fra andre metoder vil være afgørende for optimering af terapeutiske strategier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer ingen interessekonflikt.
Acknowledgments
Dette arbejde har modtaget finansiering fra Ministeriet for Videnskab og Teknologi, Taiwan [MOST 110-2314-B-006-086-MY3], National Cheng Kung University [K111-B094], [K111-B095], National Cheng Kung University Hospital, Taiwan [NCKUH-11204031], [NCKUMCS2022057].
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.22 μm filter | Merck, Taipei, Taiwan | Millex, SLGVR33RS | |
| 1.5 mL microfuge tube | Neptune, San Diego, USA | #3745 | |
| 20% Triphenyltetrazolium chloride (TTC) | Sigma-Aldrich, MO, USA | T8877 | |
| 5 mL polypropylene round bottom tube | Corning, AZ, USA | 352059 | |
| 5 mL round-bottom tube with cell strainer cap | Corning, AZ, USA | Falcon, #352235 | |
| 96-well plate | Alpha plus, Taoyuan Hsien, Taiwan | #16196 | |
| Agar | BRS, Tainan, Taiwan | AG012 | |
| Blank disk | Advantec, Tokyo, Japan | 49005040 | |
| Centrifuge | Eppendorf, UK | 5415R | |
| Ethidium bromide solution | Sigma-Aldrich, MO, USA | E1510 | |
| Fluconazole, 2 mg/mL | Pfizer, NY, USA | BC18790248 | |
| GraphPad Prism | GraphPad Software | Version 7.0 | |
| Green light emitting diode (LED) strip | Nanyi electronics Co.,Ltd, Tainan, Taiwan | 5050 | Excitation wave: 500~550 nm |
| Low Temperature. shake Incubators | Yihder, Taipei, Taiwan | LM-570D (R) | |
| Mouth care cotton swabs | Good Verita Enterprise, Taipei, Taiwan | 161357 | |
| Muller Hinton II agar | BD biosciences, California, USA | 211438 | |
| Multimode microplate reader | Molecular Devices | SpectraMax i3x | |
| OD600 spectrophotometer | Biochrom, London, UK | Ultrospec 10 | |
| Rose Bengal | Sigma-Aldrich, USA | 330000 | stock concentration 40 mg/mL = 4%, prepare in PBS, stored at 4 °C |
| Sterilized glass tube | Sunmei, Tainan, Taiwan | AK45048-16100 | |
| Yeast Extract Peptone Dextrose Medium | HIMEDIA, India | M1363 |
References
- Soriano, A., et al. Invasive candidiasis: current clinical challenges and unmet needs in adult populations. J Antimicrob Chemother. 78 (7), 1569-1585 (2023).
- Pappas, P. G., Lionakis, M. S., Arendrup, M. C., Ostrosky-Zeichner, L., Kullberg, B. J.
- Meyahnwi, D., Siraw, B. B., Reingold, A. Epidemiologic features, clinical characteristics, and predictors of mortality in patients with candidemia in Alameda County, California; a 2017-2020 retrospective analysis. BMC Infect Dis. 22 (1), 843 (2022).
- Whittaker, P. A.
- Hatab, M. A., Whittaker, P. A. Isolation and characterization of respiration-deficient mutants from the pathogenic yeast Candida albicans. Antonie Van Leeuwenhoek. 61 (3), 207-219 (1992).
- Defontaine, A., et al. In-vitro resistance to azoles associated with mitochondrial DNA deficiency in Candida glabrata. J Med Microbiol. 48 (7), 663-670 (1999).
- Brun, S., et al. Relationships between respiration and susceptibility to azole antifungals in Candida glabrata. Antimicrob Agents Chemother. 47 (3), 847-853 (2003).
- Bouchara, J. P., et al. In-vivo selection of an azole-resistant petite mutant of Candida glabrata. J Med Microbiol. 49 (11), 977-984 (2000).
- Badrane, H., et al. Genotypic diversity and unrecognized antifungal resistance among populations of Candida glabrata from positive blood cultures. Nat Commun. 14 (1), 5918 (2023).
- Shantal, C. -J. N., Juan, C. -C., Lizbeth, B. -U. S., Carlos, H. -G. J., Estela, G. -P. B. Candida glabrata is a successful pathogen: An artist manipulating the immune response. Microbiol Res. 260, 127038 (2022).
- Gamarra, S., Mancilla, E., Dudiuk, C., Garcia-Effron, G. Candida dubliniensis and Candida albicans differentiation by colony morphotype in Sabouraud-triphenyltetrazolium agar. Rev Iberoam Micol. 32 (2), 126-128 (2015).
- Hung, J. H., et al. Rose bengal-mediated photodynamic therapy to inhibit Candida albicans. J Vis Exp. (181), e63558 (2022).
- Cardoso, D. R., Franco, D. W., Olsen, K., Andersen, M. L., Skibsted, L. H. Reactivity of bovine whey proteins, peptides, and amino acids toward triplet riboflavin as studied by laser flash photolysis. J Agric Food Chem. 52 (21), 6602-6606 (2004).
- Hall, R. M., Trembath, M. K., Linnane, A. W., Wheelis, L., Criddle, R. S. Factors affecting petite induction and the recovery of respiratory competence in yeast cells exposed to ethidium bromide. Mol Gen Genet. 144 (3), 253-262 (1976).
- Chen, X. J., Clark-Walker, G. D. The petite mutation in yeasts: 50 years on. Int Rev Cytol. 194, 197-238 (2000).
- Piskur, J.
- Wong, T. W., Wang, Y. Y., Sheu, H. M., Chuang, Y. C. Bactericidal effects of toluidine blue-mediated photodynamic action on Vibrio vulnificus. Antimicrob Agents Chemother. 49 (3), 895-902 (2005).
- Wong, T. W., et al. Indocyanine green-mediated photodynamic therapy reduces methicillin-resistant Staphylococcus aureus drug resistance. J Clin Med. 8 (3), 411 (2019).
- Warrier, A., Mazumder, N., Prabhu, S., Satyamoorthy, K., Murali, T. S. Photodynamic therapy to control microbial biofilms. Photodiagnosis Photodyn Ther. 33, 102090 (2021).
- Hung, J. H., et al. Recent advances in photodynamic therapy against fungal keratitis. Pharmaceutics. 13 (12), 2011 (2021).
