啮齿动物口腔疾病模型中牙齿和牙槽骨的显微硬度测量
Summary
显微硬度是一种机械特性，也是评估硬组织病理生理学的信息参数。在这里，我们展示了一种标准化方案（样品制备、抛光、平坦表面和压痕位点），用于在啮齿动物口腔疾病模型中牙齿和牙槽骨的微硬度分析，即氟斑牙和结扎诱导的牙周骨吸收。
Abstract
在口腔疾病模型（包括氟斑牙和牙周炎）中，在牙釉质、牙本质和骨骼中评估机械性能，即显微硬度。Micro-CT （μCT） 提供 3D 成像信息（体积和矿物质密度），扫描电子显微镜 （SEM） 产生微观结构图像（牙釉质棱柱体和骨腔隙-小管）。作为对μCT和SEM结构分析的补充，显微硬度是评估结构变化如何改变机械性能的信息参数之一。尽管这是一个有用的参数，但对口腔疾病中牙槽骨微硬度的研究是有限的。迄今为止，已经报道了不同的显微硬度测量方法。由于显微硬度值根据样品制备（抛光和平坦表面）和压痕位点的不同而变化，因此不同的方案可能会导致研究之间存在差异。显微硬度协议的标准化对于口腔疾病模型的一致和准确评估至关重要。在本研究中，我们展示了牙齿和牙槽骨中显微硬度分析的标准化协议。使用的标本如下：对于氟斑牙模型，从用/没有含氟水处理 6 周的小鼠中收集切牙;对于结扎诱导的牙周骨吸收（L-PBR）模型，从上颌第2磨牙 结扎的小鼠中收集具有牙周骨吸收的牙槽骨。结扎后 2 周，收集上颌骨。根据标准化方案分析这些样品中的维氏硬度。该协议为切牙和牙槽的树脂包埋、连续抛光和压痕位点提供了详细的材料和方法。据我们所知，这是第一个标准化的微硬度协议，用于评估啮齿动物口腔疾病模型中牙齿和牙槽骨的机械性能。
Introduction
硬度是机械性能（例如弹性、硬度、粘弹性和断裂行为）之一，通常用于表征材料局部区域抵抗压缩变形和断裂的能力。静态压痕硬度测试是最常用的方法，包括维氏硬度和努氏硬度1。维氏硬度测试是通过在固定的测试载荷下将金刚石压头压入表面来实现的。压头呈金字塔形，底部为方形，相对面之间的夹角为 136°。测量在测试表面上形成的两条对角线的长度，并使用平均值来计算硬度，硬度由 F/A 比率确定（其中 F 是力，A 是压痕的表面积）。维氏显微硬度数（HV=F/A）通常以千克力（kgf）每mm2 压痕表示，1HV≈0.1891F/d2 （N/mm2）。努氏硬度也由两个不相等的相对角形成的菱形方形金字塔压头组成。努氏硬度数 （HK） 等于施加的负载与投影接触面积的比率。硬度测试分为微压痕（显微硬度）测试和宏观压痕测试，具体取决于施加在测试材料上的力。微压痕测试通常使用0.01-2 N（约1-203 gf）范围内的负载;同时，宏观压痕测试使用超过 10 N （10119 gf）1。
为了评估口腔疾病中牙齿硬组织的特征，包括牙齿和牙槽骨，使用显微CT（μCT）和扫描电子显微镜（SEM）进行结构分析。μCT 提供 3D 成像信息（体积和矿物质密度）2，SEM 产生微观结构图像（牙釉质棱镜和骨腔隙-小管）3。作为对μCT和SEM结构分析的补充，显微硬度是评估结构变化如何改变口腔疾病（例如牙釉质畸形和牙周骨吸收）中牙齿和牙槽骨机械性能的信息参数之一。人牙釉质的维氏显微硬度值（HV=283-374）约为牙本质（HV=53-63）的4-5倍4,5。在啮齿动物氟斑牙模型中，与对照牙釉质 （HV = 334） 相比，用氟化物处理的小鼠切牙 （HV = 334） 的牙釉质微硬度显着降低 6,7。这表明氟化牙釉质比非氟化牙釉质更柔软、更弱，矿物质含量更低，蛋白质含量更高。显微硬度用于评估骨骼的机械性能。之前的几项研究已经检查了来自不同解剖部位的人体骨骼的机械行为，包括长骨显微硬度 8,9,10。与非氟化股骨（HV = 294.4）相比，人氟化股骨的平均显微硬度显着降低（HV = 222.4）11。尽管这是一个有用的参数，但描述口腔疾病中牙槽骨微硬度（Vickers12 或 Knoop 13,14）的文献很少。
迄今为止，已经报道了不同的显微硬度测量方法。由于显微硬度值因样品制备（抛光和平坦表面）和压痕部位的不同而变化15 ，因此不同的方案可能会导致研究之间存在差异。显微硬度测试协议的标准化对于口腔疾病模型的一致和准确评估至关重要。在本研究中，我们展示了小鼠氟斑牙模型和牙周骨吸收模型中牙齿和牙槽骨显微硬度分析的标准化方案。
Protocol
Representative Results
Discussion
进行显微硬度测定是为了评估牙齿和骨骼等硬组织的机械性能。迄今为止，已经报道了不同的显微硬度测量方法。大多数测量信息，尤其是样品制备和压痕位点可能不足。本研究的重点是氟斑牙和牙周病模型中牙釉质和牙槽骨的显微硬度方案。为了获得一致和准确的结果，该协议中的关键步骤是样品在树脂包埋中的方向，保持评估表面与地面平行，对评估表面进行连续抛光以获得镜面光洁度，以?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
本出版物中报告的研究得到了 JSPS KAKENHI JP21K09915 （MO） 和国家普通医学科学研究所的支持;T34GM145509 （MM） 和国家牙科和颅面研究所;R01DE025255和R21DE032156（XH）;R01DE029709、R21DE028715和R15DE027851（TK）;R01DE027648 和 K02DE029531 （MS）。
Materials
| Braided Silk Suture 6-0 | Teleflex | ||
| Canica Small Animal Surgery System | Kent Scientific Corporation | SURGI 5001 | |
| CarbiMet PSA 120/P120 | Buehler | 30080120 | |
| CarbiMet PSA 60/P60 | Buehler | 36080060 | |
| CarbiMet PSA 600/P1200 | Buehler | 36080600 | |
| Castroviejo Micro Needle hilder | F.S.T | 12060-01 | |
| Epofix cold setting embeding Resin | Electron Microscopey Science | CAT-1237 | |
| Fisherbrand 112xx Series Advanced Ultrasonic Cleaner | Fisher Brand | FB11201 | |
| Fluoride-free Rodent diet | Bio Serv | F1515 | AIN-76A, 1/2" Pellets |
| in-vivo microCT Skyscan 1176 | Bruker | ||
| Isomet 1000 Precison saw | Buehler | MA112180 | |
| Lapping film 0.3µm | Maruto instrument co, LTD. Japan | 26-4203 | Alternative A3-0.3 SHT, 3M USA |
| Lapping film 1µm | Maruto instrument co, LTD. Japan | 26-4206 | Alternative A3-1 SHT, 3M USA |
| Lapping film 12µm | Maruto instrument co, LTD. Japan | 26-4211 | Alternative A3-12 SHT, 3M USA |
| Lapping film 3µm | Maruto instrument co, LTD. Japan | 26-4204 | Alternative A3-3 SHT, 3M USA |
| Lapping film 9µm | Maruto instrument co, LTD. Japan | 26-4201 | Alternative A3-9 SHT, 3M USA |
| Leica wild microscope | Leica | LEIC M690 | |
| Metaserv 2000 Variable speed Grinder polisher | Buehler | No: 557-MG1-1160 | |
| MicroCut PSA 1200/P2500 | Buehler | 36081200 | |
| MicroCut PSA P4000 | Buehler | 36084000 | |
| Microhardness tester, ALPHA-MHT-1000Z | PACE Technologies | ||
| SamplKups 1 inch | Buehler | No: 209178 | |
| Sodium Fluoride | Fisher Scientific | S299-100 | |
| West cott Stitch Scissor | JEDMED | Cat. #25-1180 | |
| ZooMed Repti Thern Undertank heater (U.T.H) | Zoo Med Laboratories, Inc. | RH-4 |
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