מדידות מיקרו-קשיות על עצם השן והנאדית במודלים של מחלות פה של מכרסמים
Summary
מיקרו-קשיות היא תכונה מכנית ופרמטר אינפורמטיבי להערכת פתופיזיולוגיה של רקמות קשות. כאן, אנו מדגימים פרוטוקול סטנדרטי (הכנת דגימה, ליטוש, משטח שטוח ואתרי הזחה) לניתוח מיקרו-קשיות בעצם השן והנאדית במודלים של מחלות פה מכרסמים, כלומר פלואורוזיס דנטלי, וספיגת עצם חניכיים הנגרמת על ידי ליגטורות.
Abstract
התכונה המכנית, מיקרו-קשיות, מוערכת באמייל השיניים, דנטין ועצם במודלים של מחלות פה, כולל פלואורוזיס דנטלי ודלקת חניכיים. מיקרו-CT (μCT) מספק מידע הדמיה תלת-ממדי (נפח וצפיפות מינרלים) ומיקרוסקופ אלקטרונים סורק (SEM) מפיק תמונות מיקרו-מבנה (מנסרת אמייל ולקונה של העצם). באופן משלים לניתוח מבני על ידי μCT ו- SEM, מיקרו-קשיות היא אחד הפרמטרים האינפורמטיביים להערכת האופן שבו שינויים מבניים משנים תכונות מכניות. למרות היותו פרמטר שימושי, מחקרים על microhardness של עצם alveolar במחלות הפה מוגבלים. עד כה דווחו שיטות מדידה שונות של מיקרו-קשיות. מכיוון שערכי המיקרו-קשיות משתנים בהתאם להכנת הדגימה (ליטוש ומשטח שטוח) ואתרי הזחה, פרוטוקולים מגוונים יכולים לגרום לפערים בין מחקרים. סטנדרטיזציה של פרוטוקול microhardness חיונית להערכה עקבית ומדויקת במודלים של מחלות הפה. במחקר הנוכחי אנו מדגימים פרוטוקול סטנדרטי לניתוח מיקרו-קשיות בשיניים ובעצם מכתשית. הדגימות המשמשות הן כדלקמן: עבור מודל פלואורוזיס דנטלי, חותכות נאספו מעכברים שטופלו עם/בלי מים המכילים פלואוריד במשך 6 שבועות; עבור מודל ספיגת עצם חניכיים (L-PBR) המושרה על ידי ליגטורה, עצמות מכתשית עם ספיגת עצם חניכיים נאספו מעכברים הקשורים על הטוחנתהשנייה המקסילרית . שבועיים לאחר הקשירה נאספה המקסילה. קשיות ויקרס נותחה בדגימות אלה על פי הפרוטוקול הסטנדרטי. הפרוטוקול מספק חומרים מפורטים ושיטות להטמעת שרף, ליטוש סדרתי ואתרי הזחה לשיניים חותכות ונאדיות. למיטב ידיעתנו, זהו פרוטוקול המיקרו-קשיות הסטנדרטי הראשון להערכת התכונות המכניות של עצם השן והנאדית במודלים של מחלות פה מכרסמים.
Introduction
קשיות היא אחת התכונות המכניות (למשל, גמישות, קשיות, צמיגות והתנהגות שבר) והיא משמשת בדרך כלל לאפיון היכולת להתנגד לעיוות דחיסה ושבר של אזור מקומי בחומר. בדיקת קשיות הכניסה הסטטית היא השיטה הנפוצה ביותר, כולל קשיות ויקרס וקשיות קנופ1. בדיקת הקשיות של ויקרס מיושמת על ידי לחיצה על אינדנדר יהלום לתוך המשטח תחת עומס בדיקה קבוע. האינדנטר הוא בצורת פירמידה, עם בסיס מרובע וזווית של 136° בין פאות מנוגדות. אורך שני האלכסונים שנוצרו על משטח הבדיקה נמדד, והממוצע משמש לחישוב הקשיות, הנקבעת על ידי היחס F/A (כאשר F הוא הכוח ו- A הוא שטח הפנים של הכניסה). מספר המיקרו-קשיות של ויקרס (HV=F/A) מבוטא בדרך כלל בכוח קילוגרמים (kgf) לכל כניסה למ”מ2 , עם 1 HV ≈ 0.1891 F/d2 (N/mm2). קשיות קנופ מורכבת גם מפירמידה מרובעת יהלום הנוצרת על ידי שתי זוויות מנוגדות לא שוות. מספר קשיות Knoop (HK) שווה ליחס בין העומס המופעל לאזור המגע הצפוי. בדיקות קשיות מסווגות לבדיקות מיקרו-הזחה (micro-hardness) ובדיקות מאקרו-הזחה, בהתאם לכוח המופעל על חומר הבדיקה. בדיקות מיקרו-הזחה משתמשות בדרך כלל בעומסים בטווח 0.01-2 N (בערך 1-203 gf); בינתיים, בדיקות כניסה מאקרו משתמשות ביותר מ- 10 N (10119 gf)1.
כדי להעריך תכונות של רקמות קשות דנטליות במחלות פה, כולל עצם השן והנאדיות, מיקרו-CT (μCT) ומיקרוסקופ אלקטרונים סורק (SEM) משמשים לניתוח מבני. μCT מספק מידע הדמיה תלת-ממדי (נפח וצפיפות מינרלים)2, ו-SEM מפיק תמונות מיקרו-מבנה (מנסרת אמייל ולקונה של עצמות)3. באופן משלים לניתוח מבני על ידי μCT ו- SEM, מיקרו-קשיות היא אחד הפרמטרים האינפורמטיביים להערכת האופן שבו שינויים מבניים משנים את התכונות המכניות של עצם השן והנאדית במחלות פה, למשל, מום באמייל וספיגת עצם חניכיים. ערך המיקרו-קשיות של אמייל האדם של ויקרס (HV = 283-374) גבוה בערך פי 4 עד 5 מזה של דנטין (HV = 53-63)4,5. במודלים של פלואורוזיס דנטלי של מכרסמים, מיקרו-קשיות האמייל יורדת באופן משמעותי בחותכות עכבר המטופלות בפלואוריד (HV = 136) בהשוואה לאמייל הבקרה (HV = 334)6,7. זה מצביע על כך שאמייל פלואורוז הוא רך וחלש יותר עם תכולת מינרלים נמוכה יותר ותכולת חלבון גבוהה יותר מאשר נמצא באמייל שאינו פלואורוז. Microhardness משמש להערכת תכונות מכניות העצם. מספר מחקרים קודמים בחנו את ההתנהגות המכנית של עצם אנושית מאתרים אנטומיים שונים, כולל מיקרו-קשיות עצם ארוכה 8,9,10. המיקרו-קשיות הממוצעת של עצם הירך הפלואורוזית האנושית הראתה ירידה משמעותית (HV = 222.4) בהשוואה לעצם הירך שאינה פלואורוזית (HV = 294.4)11. למרות היותו פרמטר שימושי, קיים מחסור בספרות המתארת מיקרו-קשיות (ויקרס12 או קנופ 13,14) של עצם מכתשית במחלות אוראליות.
עד כה דווחו שיטות מדידה שונות של מיקרו-קשיות. מכיוון שערכי המיקרו-קשיות משתניםב-15 בהתאם להכנת הדגימה (ליטוש ומשטח שטוח) ולאתר ההזחה, פרוטוקולים מגוונים עלולים לגרום לפערים בין מחקרים. סטנדרטיזציה של פרוטוקול בדיקת microhardness חיונית להערכה עקבית ומדויקת במודלים של מחלות הפה. במחקר הנוכחי אנו מדגימים פרוטוקול סטנדרטי לניתוח מיקרו-קשיות בעצם השן והנאדית במודל פלואורוזיס דנטלי של עכבר ובמודל ספיגת עצם חניכיים.
Protocol
Representative Results
Discussion
מיקרו-קשיות מבוצעת כדי להעריך תכונות מכניות של רקמות קשות כמו שן ועצם. עד כה דווחו שיטות מדידה שונות של מיקרו-קשיות. רוב מידע המדידה, במיוחד הכנות הדגימה ואתרי ההזחה עשויים להיות לא מספיקים. מחקר זה התמקד בפרוטוקול מיקרו-קשיות עבור אמייל ועצם מכתשית במודלים של פלואורוזיס דנטלי ומחלות חניכ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחקר שדווח בפרסום זה נתמך על ידי JSPS KAKENHI JP21K09915 (MO) והמכון הלאומי למדעי הרפואה הכלליים; T34GM145509 (MM) והמכון הלאומי למחקר שיניים וקרניופציאליות; R01DE025255 R21DE032156 (XH); R01DE029709, R21DE028715 R15DE027851 (TK); R01DE027648 ו K02DE029531 (MS).
Materials
| Braided Silk Suture 6-0 | Teleflex | ||
| Canica Small Animal Surgery System | Kent Scientific Corporation | SURGI 5001 | |
| CarbiMet PSA 120/P120 | Buehler | 30080120 | |
| CarbiMet PSA 60/P60 | Buehler | 36080060 | |
| CarbiMet PSA 600/P1200 | Buehler | 36080600 | |
| Castroviejo Micro Needle hilder | F.S.T | 12060-01 | |
| Epofix cold setting embeding Resin | Electron Microscopey Science | CAT-1237 | |
| Fisherbrand 112xx Series Advanced Ultrasonic Cleaner | Fisher Brand | FB11201 | |
| Fluoride-free Rodent diet | Bio Serv | F1515 | AIN-76A, 1/2" Pellets |
| in-vivo microCT Skyscan 1176 | Bruker | ||
| Isomet 1000 Precison saw | Buehler | MA112180 | |
| Lapping film 0.3µm | Maruto instrument co, LTD. Japan | 26-4203 | Alternative A3-0.3 SHT, 3M USA |
| Lapping film 1µm | Maruto instrument co, LTD. Japan | 26-4206 | Alternative A3-1 SHT, 3M USA |
| Lapping film 12µm | Maruto instrument co, LTD. Japan | 26-4211 | Alternative A3-12 SHT, 3M USA |
| Lapping film 3µm | Maruto instrument co, LTD. Japan | 26-4204 | Alternative A3-3 SHT, 3M USA |
| Lapping film 9µm | Maruto instrument co, LTD. Japan | 26-4201 | Alternative A3-9 SHT, 3M USA |
| Leica wild microscope | Leica | LEIC M690 | |
| Metaserv 2000 Variable speed Grinder polisher | Buehler | No: 557-MG1-1160 | |
| MicroCut PSA 1200/P2500 | Buehler | 36081200 | |
| MicroCut PSA P4000 | Buehler | 36084000 | |
| Microhardness tester, ALPHA-MHT-1000Z | PACE Technologies | ||
| SamplKups 1 inch | Buehler | No: 209178 | |
| Sodium Fluoride | Fisher Scientific | S299-100 | |
| West cott Stitch Scissor | JEDMED | Cat. #25-1180 | |
| ZooMed Repti Thern Undertank heater (U.T.H) | Zoo Med Laboratories, Inc. | RH-4 |
References
- Broitman, E. Indentation hardness measurements at macro-, micro-, and nanoscale: A critical overview. Tribol Lett. 65 (1), 23 (2017).
- Lee, M. J., et al. Sirt6 activation ameliorates inflammatory bone loss in ligature-induced periodontitis in mice. Int J Mol Sci. 24 (13), 10714 (2023).
- Min, J., et al. Investigation on the gradient nanomechanical behavior of dental fluorosis enamel. Nanoscale Res Lett. 13 (1), 347 (2018).
- Craig, R. G., Peyton, F. A. The micro-hardness of enamel and dentin. J Dent Res. 37 (4), 661-668 (1958).
- Chun, K., Choi, H., Lee, J. Comparison of mechanical property and role between enamel and dentin in the human teeth. J Dent Biomech. 5, (2014).
- Suzuki, M., Everett, E. T., Whitford, G. M., Bartlett, J. D. 4-phenylbutyrate mitigates fluoride-induced cytotoxicity in alc cells. Front Physiol. 8, 302 (2017).
- Sharma, R., et al. Assessment of dental fluorosis in mmp20 +/- mice. J Dent Res. 90 (6), 788-792 (2011).
- Wu, W. W., et al. Bone hardness of different anatomical regions of human radius and its impact on the pullout strength of screws. Orthop Surg. 11 (2), 270-276 (2019).
- Li, S., et al. Atlas of human skeleton hardness obtained using the micro-indentation technique. Orthop Surg. 13 (4), 1417-1422 (2021).
- Ibrahim, A., et al. Hardness an important indicator of bone quality, and the role of collagen in bone hardness. J Funct Biomater. 11 (4), 85 (2020).
- Vandana, K. L., Srishti Raj, B., Desai, R. Dental fluorosis and periodontium: An original research report of in vitro and in vivo institutional studies. Biol Trace Elem Res. 199 (10), 3579-3592 (2021).
- Xia, P. F., et al. Microcarriers containing "hypoxia-engine" for simultaneous enhanced osteogenesis and angiogenesis. Chemical Engineering Journal. 456, 141014 (2023).
- Chiu, R., et al. Effects of biglycan on physico-chemical properties of ligament-mineralized tissue attachment sites. Arch Oral Biol. 57 (2), 177-187 (2012).
- Leong, N. L., et al. Age-related adaptation of bone-pdl-tooth complex: Rattus-norvegicus as a model system. PLoS One. 7 (4), e35980 (2012).
- Johnson, W. M., Rapoff, A. J. Microindentation in bone: Hardness variation with five independent variables. J Mater Sci Mater Med. 18 (4), 591-597 (2007).
- Kweon, Y. S., et al. Effects of fam83h overexpression on enamel and dentine formation. Arch Oral Biol. 58 (9), 1148-1154 (2013).
- Boivin, G., et al. The role of mineralization and organic matrix in the microhardness of bone tissue from controls and osteoporotic patients. Bone. 43 (3), 532-538 (2008).
- Okamoto, M., et al. Microstructural evaluation of the mineralized apical barrier induced by a calcium hydroxide paste containing iodoform: A case report. J Endod. 2 (2), 243-251 (2024).
- Wang, Y., et al. B10 cells alleviate periodontal bone loss in experimental periodontitis. Infect Immun. 85 (9), e00335 (2017).
- Chen, Y., et al. Nlrp3 regulates alveolar bone loss in ligature-induced periodontitis by promoting osteoclastic differentiation. Cell Prolif. 54 (2), e12973 (2021).
- Robinson, J. W., et al. Male mice with elevated c-type natriuretic peptide-dependent guanylyl cyclase-b activity have increased osteoblasts, bone mass and bone strength. Bone. 135, 115320 (2020).
