Измерение микротвердости зубов и альвеолярной кости на моделях заболеваний полости рта грызунов
Summary
Микротвердость — это механическое свойство и информативный параметр для оценки патофизиологии твердых тканей. Здесь мы демонстрируем стандартизированный протокол (подготовка образцов, полировка, плоская поверхность и участки вдавливания) для анализа микротвердости зубов и альвеолярной кости на моделях заболеваний полости рта грызунов, а именно флюороз зубов и лигатурно-индуцированная резорбция пародонтальной кости.
Abstract
Механические свойства, микротвердость, оцениваются в зубной эмали, дентине и кости на моделях заболеваний полости рта, включая флюороз зубов и пародонтит. Микро-КТ (μКТ) предоставляет 3D-визуализацию информации (объем и минеральная плотность), а сканирующая электронная микроскопия (СЭМ) создает изображения микроструктуры (эмалевая призма и костная лакуна-каналикулярная). В дополнение к структурному анализу с помощью μCT и SEM микротвердость является одним из информативных параметров для оценки того, как структурные изменения изменяют механические свойства. Несмотря на то, что это полезный параметр, исследования микротвердости альвеолярной кости при заболеваниях полости рта ограничены. На сегодняшний день сообщалось о расходящихся методах измерения микротвердости. Поскольку значения микротвердости варьируются в зависимости от подготовки образца (полировка и плоская поверхность) и места вдавливания, различные протоколы могут привести к расхождениям между исследованиями. Стандартизация протокола микротвердости имеет важное значение для последовательной и точной оценки в моделях заболеваний полости рта. В настоящем исследовании мы демонстрируем стандартизированный протокол анализа микротвердости зубов и альвеолярной кости. Использовались следующие образцы: для модели флюороза зубов резцы собирали у мышей, обработанных фторсодержащей водой или без нее в течение 6 недель; для модели лигатурно-индуцированной резорбции пародонтальной кости (L-PBR) альвеолярные кости с резорбцией пародонтальной кости были собраны у мышей, перевязанных на2-м моляре верхней челюсти. Через 2 недели после перевязки была собрана верхняя челюсть. Твердость по Виккерсу анализировали в этих образцах по стандартизированному протоколу. Протокол предоставляет подробные материалы и методы для внедрения смолы, серийной полировки и вдавливания резцов и альвеолярных отверстий. Насколько нам известно, это первый стандартизированный протокол микротвердости для оценки механических свойств зуба и альвеолярной кости в моделях заболеваний полости рта грызунов.
Introduction
Твердость является одним из механических свойств (например, эластичность, твердость, вязкоупругость и поведение при разрушении) и обычно используется для характеристики способности противостоять деформации при сжатии и разрушению локальной области материала. Статический тест на твердость при вдавливании является наиболее часто используемым методом, включая твердость по Виккерсу и твердость по Кнупу1. Испытание на твердость по Виккерсу осуществляется путем вдавливания алмазного индентора в поверхность под действием фиксированной испытательной нагрузки. Индентор имеет форму пирамиды, с квадратным основанием и углом 136° между противоположными гранями. Измеряется длина обеих диагоналей, сформированных на поверхности испытания, и среднее значение используется для расчета твердости, которая определяется отношением F/A (где F — сила, а A — площадь поверхности вдавливания). Число микротвердости по Виккерсу (HV = F/A) обычно выражается в килограммах-силе (кгс) на мм2 вдавливания, при этом 1 HV ≈ 0,1891 F/d2 (N/мм2). Твердость по Кнупу также состоит из алмазного квадратного пирамидального индентора, образованного двумя неравными противоположными углами. Число твердости Кнупа (HK) равно отношению приложенной нагрузки к проектируемой площади контакта. Испытания на твердость подразделяются на испытания на микровдавливание (микротвердость) и испытания на макровдавливание в зависимости от силы, приложенной к испытуемому материалу. При испытаниях на микроиндентирование обычно используются нагрузки в диапазоне 0,01-2 Н (около 1-203 гс); в то же время в тестах с макроиндентированием используется более 10 Н (10119 gf)1.
Для оценки особенностей твердых тканей зубов при заболеваниях полости рта, включая зубы и альвеолярную кость, для структурного анализа используют микро-КТ (μКТ) и сканирующую электронную микроскопию (СЭМ). μКТ предоставляет информацию 3D-визуализации (объем и минеральная плотность)2, а СЭМ создает изображения микроструктуры (призма эмали и костная лакуна-каналик)3. В дополнение к структурному анализу с помощью μCT и SEM, микротвердость является одним из информативных параметров для оценки того, как структурные изменения изменяют механические свойства зуба и альвеолярной кости при заболеваниях полости рта, например, при пороках развития эмали и резорбции кости пародонта. Значение микротвердости по Виккерсу эмали человека (HV = 283-374) примерно в 4-5 раз выше, чем у дентина (HV = 53-63)4,5. В моделях флюороза зубов грызунов микротвердость эмали значительно снижается в резцах мышей, обработанных фтором (HV = 136), по сравнению с контрольной эмалью (HV = 334)6,7. Это говорит о том, что фторизованная эмаль мягче и слабее с меньшим содержанием минералов и более высоким содержанием белка, чем в нефторизованной эмали. Микротвердость используется для оценки механических свойств кости. В нескольких предыдущих исследованиях изучалось механическое поведение человеческой кости из различных анатомических участков, включая микротвердость длинной кости 8,9,10. Средняя микротвердость фторированных бедренных костей человека показала значительное снижение (HV = 222,4) по сравнению с нефторированными бедренными копытами (HV = 294,4)11. Несмотря на то, что это полезный параметр, существует мало литературы, описывающей микротвердость (либо по Виккерсу12, либо по Кнупу 13,14) альвеолярной кости при заболеваниях полости рта.
На сегодняшний день сообщалось о расходящихся методах измерения микротвердости. Поскольку значения микротвердости варьируются15 в зависимости от подготовки образца (полировка и плоская поверхность) и места вдавливания, различные протоколы могут привести к расхождениям между исследованиями. Стандартизация протокола определения микротвердости имеет важное значение для последовательной и точной оценки в моделях заболеваний полости рта. В настоящем исследовании мы демонстрируем стандартизированный протокол анализа микротвердости зубов и альвеолярной кости в модели флюороза зубов мышей и модели резорбции костной ткани пародонта.
Protocol
Representative Results
Discussion
Микротвердость выполняется для оценки механических свойств твердых тканей, таких как зуб и кость. На сегодняшний день сообщалось о расходящихся методах измерения микротвердости. Большая часть информации об измерениях, особенно подготовка образцов и места вдавливания, вероятно, будет…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Исследования, представленные в этой публикации, были поддержаны JSPS KAKENHI JP21K09915 (MO) и Национальным институтом общих медицинских наук; T34GM145509 (MM) и Национальный институт стоматологических и черепно-лицевых исследований; R01DE025255 и R21DE032156 (XH); R01DE029709, R21DE028715 и R15DE027851 (ТЗ); R01DE027648 и K02DE029531 (РС).
Materials
| Braided Silk Suture 6-0 | Teleflex | ||
| Canica Small Animal Surgery System | Kent Scientific Corporation | SURGI 5001 | |
| CarbiMet PSA 120/P120 | Buehler | 30080120 | |
| CarbiMet PSA 60/P60 | Buehler | 36080060 | |
| CarbiMet PSA 600/P1200 | Buehler | 36080600 | |
| Castroviejo Micro Needle hilder | F.S.T | 12060-01 | |
| Epofix cold setting embeding Resin | Electron Microscopey Science | CAT-1237 | |
| Fisherbrand 112xx Series Advanced Ultrasonic Cleaner | Fisher Brand | FB11201 | |
| Fluoride-free Rodent diet | Bio Serv | F1515 | AIN-76A, 1/2" Pellets |
| in-vivo microCT Skyscan 1176 | Bruker | ||
| Isomet 1000 Precison saw | Buehler | MA112180 | |
| Lapping film 0.3µm | Maruto instrument co, LTD. Japan | 26-4203 | Alternative A3-0.3 SHT, 3M USA |
| Lapping film 1µm | Maruto instrument co, LTD. Japan | 26-4206 | Alternative A3-1 SHT, 3M USA |
| Lapping film 12µm | Maruto instrument co, LTD. Japan | 26-4211 | Alternative A3-12 SHT, 3M USA |
| Lapping film 3µm | Maruto instrument co, LTD. Japan | 26-4204 | Alternative A3-3 SHT, 3M USA |
| Lapping film 9µm | Maruto instrument co, LTD. Japan | 26-4201 | Alternative A3-9 SHT, 3M USA |
| Leica wild microscope | Leica | LEIC M690 | |
| Metaserv 2000 Variable speed Grinder polisher | Buehler | No: 557-MG1-1160 | |
| MicroCut PSA 1200/P2500 | Buehler | 36081200 | |
| MicroCut PSA P4000 | Buehler | 36084000 | |
| Microhardness tester, ALPHA-MHT-1000Z | PACE Technologies | ||
| SamplKups 1 inch | Buehler | No: 209178 | |
| Sodium Fluoride | Fisher Scientific | S299-100 | |
| West cott Stitch Scissor | JEDMED | Cat. #25-1180 | |
| ZooMed Repti Thern Undertank heater (U.T.H) | Zoo Med Laboratories, Inc. | RH-4 |
References
- Broitman, E. Indentation hardness measurements at macro-, micro-, and nanoscale: A critical overview. Tribol Lett. 65 (1), 23 (2017).
- Lee, M. J., et al. Sirt6 activation ameliorates inflammatory bone loss in ligature-induced periodontitis in mice. Int J Mol Sci. 24 (13), 10714 (2023).
- Min, J., et al. Investigation on the gradient nanomechanical behavior of dental fluorosis enamel. Nanoscale Res Lett. 13 (1), 347 (2018).
- Craig, R. G., Peyton, F. A. The micro-hardness of enamel and dentin. J Dent Res. 37 (4), 661-668 (1958).
- Chun, K., Choi, H., Lee, J. Comparison of mechanical property and role between enamel and dentin in the human teeth. J Dent Biomech. 5, (2014).
- Suzuki, M., Everett, E. T., Whitford, G. M., Bartlett, J. D. 4-phenylbutyrate mitigates fluoride-induced cytotoxicity in alc cells. Front Physiol. 8, 302 (2017).
- Sharma, R., et al. Assessment of dental fluorosis in mmp20 +/- mice. J Dent Res. 90 (6), 788-792 (2011).
- Wu, W. W., et al. Bone hardness of different anatomical regions of human radius and its impact on the pullout strength of screws. Orthop Surg. 11 (2), 270-276 (2019).
- Li, S., et al. Atlas of human skeleton hardness obtained using the micro-indentation technique. Orthop Surg. 13 (4), 1417-1422 (2021).
- Ibrahim, A., et al. Hardness an important indicator of bone quality, and the role of collagen in bone hardness. J Funct Biomater. 11 (4), 85 (2020).
- Vandana, K. L., Srishti Raj, B., Desai, R. Dental fluorosis and periodontium: An original research report of in vitro and in vivo institutional studies. Biol Trace Elem Res. 199 (10), 3579-3592 (2021).
- Xia, P. F., et al. Microcarriers containing "hypoxia-engine" for simultaneous enhanced osteogenesis and angiogenesis. Chemical Engineering Journal. 456, 141014 (2023).
- Chiu, R., et al. Effects of biglycan on physico-chemical properties of ligament-mineralized tissue attachment sites. Arch Oral Biol. 57 (2), 177-187 (2012).
- Leong, N. L., et al. Age-related adaptation of bone-pdl-tooth complex: Rattus-norvegicus as a model system. PLoS One. 7 (4), e35980 (2012).
- Johnson, W. M., Rapoff, A. J. Microindentation in bone: Hardness variation with five independent variables. J Mater Sci Mater Med. 18 (4), 591-597 (2007).
- Kweon, Y. S., et al. Effects of fam83h overexpression on enamel and dentine formation. Arch Oral Biol. 58 (9), 1148-1154 (2013).
- Boivin, G., et al. The role of mineralization and organic matrix in the microhardness of bone tissue from controls and osteoporotic patients. Bone. 43 (3), 532-538 (2008).
- Okamoto, M., et al. Microstructural evaluation of the mineralized apical barrier induced by a calcium hydroxide paste containing iodoform: A case report. J Endod. 2 (2), 243-251 (2024).
- Wang, Y., et al. B10 cells alleviate periodontal bone loss in experimental periodontitis. Infect Immun. 85 (9), e00335 (2017).
- Chen, Y., et al. Nlrp3 regulates alveolar bone loss in ligature-induced periodontitis by promoting osteoclastic differentiation. Cell Prolif. 54 (2), e12973 (2021).
- Robinson, J. W., et al. Male mice with elevated c-type natriuretic peptide-dependent guanylyl cyclase-b activity have increased osteoblasts, bone mass and bone strength. Bone. 135, 115320 (2020).
