Mikrohårdhetsmätningar på tand och alveolärt ben i modeller av orala sjukdomar hos gnagare
Summary
Mikrohårdhet är en mekanisk egenskap och en informativ parameter för att utvärdera hårdvävnadpatofysiologi. Här demonstrerar vi ett standardiserat protokoll (provberedning, polering, plan yta och fördjupningsställen) för mikrohårdhetsanalys i tand och alveolärt ben i orala sjukdomsmodeller för gnagare, nämligen dental fluoros och ligaturinducerad parodontal benresorption.
Abstract
Den mekaniska egenskapen, mikrohårdhet, utvärderas i tandemalj, dentin och ben i orala sjukdomsmodeller, inklusive tandfluoros och parodontit. Micro-CT (μCT) ger 3D-avbildningsinformation (volym och mineraldensitet) och svepelektronmikroskopi (SEM) producerar mikrostrukturbilder (emaljprisma och benlacuna-canalicular). Som ett komplement till strukturanalys med μCT och SEM är mikrohårdhet en av de informativa parametrarna för att utvärdera hur strukturella förändringar förändrar mekaniska egenskaper. Trots att det är en användbar parameter är studier av mikrohårdhet hos alveolärt ben vid orala sjukdomar begränsade. Hittills har metoder för mätning av divergerande mikrohårdhet rapporterats. Eftersom mikrohårdhetsvärdena varierar beroende på provberedningen (polering och plan yta) och fördjupningsställen, kan olika protokoll orsaka skillnader mellan studierna. Standardisering av mikrohårdhetsprotokollet är avgörande för konsekvent och korrekt utvärdering i orala sjukdomsmodeller. I den aktuella studien visar vi ett standardiserat protokoll för mikrohårdhetsanalys i tand och alveolärt ben. Prover som används är följande: för den dentala fluorosmodellen samlades framtänder in från möss som behandlats med/utan fluorhaltigt vatten i 6 veckor; för ligaturinducerad parodontal benresorption (L-PBR) modell samlades alveolära ben med parodontal benresorption in från möss som ligerade på den maxillära 2:a molaren. 2 veckor efter ligeringen samlades överkäken in. Vickers hårdhet analyserades i dessa prover enligt det standardiserade protokollet. Protokollet tillhandahåller detaljerade material och metoder för hartsinbäddning, seriepolering och fördjupningsställen för framtänder och alveolar. Så vitt vi vet är detta det första standardiserade mikrohårdhetsprotokollet för att utvärdera de mekaniska egenskaperna hos tänder och alveolarben i modeller för orala sjukdomar hos gnagare.
Introduction
Hårdhet är en av de mekaniska egenskaperna (t.ex. elasticitet, hårdhet, viskoelasticitet och brottbeteende) och används ofta för att karakterisera förmågan att motstå kompressionsdeformation och brott i ett lokalt område av ett material. Det statiska intryckningshårdhetstestet är den mest använda metoden, inklusive Vickers hårdhet och Knoop hårdhet1. Vickers hårdhetstest implementeras genom att pressa en diamantindenter i ytan under en fast testbelastning. Indenteraren är pyramidformad, med en kvadratisk bas och en vinkel på 136° mellan motsatta ytor. Längden på båda diagonalerna som bildas på testytan mäts, och medelvärdet används för att beräkna hårdheten, som bestäms av förhållandet F/A (där F är kraften och A är fördjupningens yta). Vickers mikrohårdhetstal (HV=F/A) uttrycks vanligtvis i kilogram-kraft (kgf) per mm2 intryck, med 1 HV ≈ 0,1891 F/d2 (N/mm2). Knoop-hårdheten består också av en diamant kvadratisk pyramid indenterare bildad av två olika motsatta vinklar. Knoop-hårdhetstalet (HK) är lika med förhållandet mellan applicerad belastning och den projicerade kontaktytan. Hårdhetstester klassificeras i mikrointryckstester (mikrohårdhet) och makrointryckstester, beroende på den kraft som appliceras på testmaterialet. Mikrointryckstester använder vanligtvis belastningar i intervallet 0,01-2 N (cirka 1-203 gf); Samtidigt använder makroindentationstester över 10 N (10119 gf)1.
För att utvärdera egenskaper hos dentala hårda vävnader vid orala sjukdomar, inklusive tand och alveolarben, används mikro-CT (μCT) och svepelektronmikroskopi (SEM) för strukturell analys. μCT tillhandahåller 3D-avbildningsinformation (volym och mineraldensitet)2, och SEM producerar mikrostrukturbilder (emaljprisma och benlucka-kanalikulär)3. Som ett komplement till strukturell analys med μCT och SEM är mikrohårdhet en av de informativa parametrarna för att utvärdera hur strukturella förändringar förändrar de mekaniska egenskaperna hos tand och alveolärt ben vid orala sjukdomar, t.ex. emaljmissbildning och parodontal benresorption. Vickers mikrohårdhetsvärde för human emalj (HV = 283-374) är cirka 4 till 5 gånger högre än för dentin (HV = 53-63)4,5. I modeller med tandfluoros hos gnagare minskar emaljens mikrohårdhet signifikant i mössframtänder som behandlats med fluor (HV = 136) jämfört med kontrollemaljen (HV = 334)6,7. Detta tyder på att fluoroserad emalj är mjukare och svagare med lägre mineralinnehåll och högre proteininnehåll än vad som finns i icke-fluoroserad emalj. Mikrohårdhet används för att utvärdera benets mekaniska egenskaper. Flera tidigare studier har undersökt det mekaniska beteendet hos mänskligt ben från olika anatomiska platser, inklusive lång benmikrohårdhet 8,9,10. Den genomsnittliga mikrohårdheten hos humanfluoroserade lårben visade en signifikant minskning (HV = 222,4) jämfört med icke-fluoroserade lårben (HV = 294,4)11. Trots att det är en användbar parameter finns det en brist på litteratur som beskriver mikrohårdhet (antingen Vickers12 eller Knoop 13,14) av alveolärt ben vid orala sjukdomar.
Hittills har metoder för mätning av divergerande mikrohårdhet rapporterats. Eftersom mikrohårdhetsvärdena varierar15 beroende på provberedning (polering och plan yta) och intryckningsställe, kan olika protokoll orsaka skillnader mellan studier. Standardisering av testprotokollet för mikrohårdhet är avgörande för konsekvent och korrekt utvärdering i orala sjukdomsmodeller. I den aktuella studien demonstrerar vi ett standardiserat protokoll för mikrohårdhetsanalys i tand och alveolärt ben i en tandfluorosmodell för möss och en parodontal benresorptionsmodell.
Protocol
Representative Results
Discussion
Mikrohårdhet utförs för att utvärdera mekaniska egenskaper hos hårda vävnader som tand och ben. Hittills har metoder för mätning av divergerande mikrohårdhet rapporterats. Största delen av mätinformationen, särskilt provberedningarna och fördjupningsställena, är sannolikt otillräckliga. Denna studie fokuserade på mikrohårdhetsprotokollet för emalj och alveolärt ben i modeller för tandfluoros och parodontala sjukdomar. För att få konsekventa och exakta resultat är de kritiska stegen i detta protoko…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forskning som rapporteras i denna publikation stöddes av JSPS KAKENHI JP21K09915 (MO) och National Institute of General Medical Sciences; T34GM145509 (MM) och National Institute of Dental and Craniofacial Research; R01DE025255 och R21DE032156 (XH); R01DE029709, R21DE028715 och R15DE027851 (TK); R01DE027648 och K02DE029531 (medlemsstaterna).
Materials
| Braided Silk Suture 6-0 | Teleflex | ||
| Canica Small Animal Surgery System | Kent Scientific Corporation | SURGI 5001 | |
| CarbiMet PSA 120/P120 | Buehler | 30080120 | |
| CarbiMet PSA 60/P60 | Buehler | 36080060 | |
| CarbiMet PSA 600/P1200 | Buehler | 36080600 | |
| Castroviejo Micro Needle hilder | F.S.T | 12060-01 | |
| Epofix cold setting embeding Resin | Electron Microscopey Science | CAT-1237 | |
| Fisherbrand 112xx Series Advanced Ultrasonic Cleaner | Fisher Brand | FB11201 | |
| Fluoride-free Rodent diet | Bio Serv | F1515 | AIN-76A, 1/2" Pellets |
| in-vivo microCT Skyscan 1176 | Bruker | ||
| Isomet 1000 Precison saw | Buehler | MA112180 | |
| Lapping film 0.3µm | Maruto instrument co, LTD. Japan | 26-4203 | Alternative A3-0.3 SHT, 3M USA |
| Lapping film 1µm | Maruto instrument co, LTD. Japan | 26-4206 | Alternative A3-1 SHT, 3M USA |
| Lapping film 12µm | Maruto instrument co, LTD. Japan | 26-4211 | Alternative A3-12 SHT, 3M USA |
| Lapping film 3µm | Maruto instrument co, LTD. Japan | 26-4204 | Alternative A3-3 SHT, 3M USA |
| Lapping film 9µm | Maruto instrument co, LTD. Japan | 26-4201 | Alternative A3-9 SHT, 3M USA |
| Leica wild microscope | Leica | LEIC M690 | |
| Metaserv 2000 Variable speed Grinder polisher | Buehler | No: 557-MG1-1160 | |
| MicroCut PSA 1200/P2500 | Buehler | 36081200 | |
| MicroCut PSA P4000 | Buehler | 36084000 | |
| Microhardness tester, ALPHA-MHT-1000Z | PACE Technologies | ||
| SamplKups 1 inch | Buehler | No: 209178 | |
| Sodium Fluoride | Fisher Scientific | S299-100 | |
| West cott Stitch Scissor | JEDMED | Cat. #25-1180 | |
| ZooMed Repti Thern Undertank heater (U.T.H) | Zoo Med Laboratories, Inc. | RH-4 |
References
- Broitman, E. Indentation hardness measurements at macro-, micro-, and nanoscale: A critical overview. Tribol Lett. 65 (1), 23 (2017).
- Lee, M. J., et al. Sirt6 activation ameliorates inflammatory bone loss in ligature-induced periodontitis in mice. Int J Mol Sci. 24 (13), 10714 (2023).
- Min, J., et al. Investigation on the gradient nanomechanical behavior of dental fluorosis enamel. Nanoscale Res Lett. 13 (1), 347 (2018).
- Craig, R. G., Peyton, F. A. The micro-hardness of enamel and dentin. J Dent Res. 37 (4), 661-668 (1958).
- Chun, K., Choi, H., Lee, J. Comparison of mechanical property and role between enamel and dentin in the human teeth. J Dent Biomech. 5, (2014).
- Suzuki, M., Everett, E. T., Whitford, G. M., Bartlett, J. D. 4-phenylbutyrate mitigates fluoride-induced cytotoxicity in alc cells. Front Physiol. 8, 302 (2017).
- Sharma, R., et al. Assessment of dental fluorosis in mmp20 +/- mice. J Dent Res. 90 (6), 788-792 (2011).
- Wu, W. W., et al. Bone hardness of different anatomical regions of human radius and its impact on the pullout strength of screws. Orthop Surg. 11 (2), 270-276 (2019).
- Li, S., et al. Atlas of human skeleton hardness obtained using the micro-indentation technique. Orthop Surg. 13 (4), 1417-1422 (2021).
- Ibrahim, A., et al. Hardness an important indicator of bone quality, and the role of collagen in bone hardness. J Funct Biomater. 11 (4), 85 (2020).
- Vandana, K. L., Srishti Raj, B., Desai, R. Dental fluorosis and periodontium: An original research report of in vitro and in vivo institutional studies. Biol Trace Elem Res. 199 (10), 3579-3592 (2021).
- Xia, P. F., et al. Microcarriers containing "hypoxia-engine" for simultaneous enhanced osteogenesis and angiogenesis. Chemical Engineering Journal. 456, 141014 (2023).
- Chiu, R., et al. Effects of biglycan on physico-chemical properties of ligament-mineralized tissue attachment sites. Arch Oral Biol. 57 (2), 177-187 (2012).
- Leong, N. L., et al. Age-related adaptation of bone-pdl-tooth complex: Rattus-norvegicus as a model system. PLoS One. 7 (4), e35980 (2012).
- Johnson, W. M., Rapoff, A. J. Microindentation in bone: Hardness variation with five independent variables. J Mater Sci Mater Med. 18 (4), 591-597 (2007).
- Kweon, Y. S., et al. Effects of fam83h overexpression on enamel and dentine formation. Arch Oral Biol. 58 (9), 1148-1154 (2013).
- Boivin, G., et al. The role of mineralization and organic matrix in the microhardness of bone tissue from controls and osteoporotic patients. Bone. 43 (3), 532-538 (2008).
- Okamoto, M., et al. Microstructural evaluation of the mineralized apical barrier induced by a calcium hydroxide paste containing iodoform: A case report. J Endod. 2 (2), 243-251 (2024).
- Wang, Y., et al. B10 cells alleviate periodontal bone loss in experimental periodontitis. Infect Immun. 85 (9), e00335 (2017).
- Chen, Y., et al. Nlrp3 regulates alveolar bone loss in ligature-induced periodontitis by promoting osteoclastic differentiation. Cell Prolif. 54 (2), e12973 (2021).
- Robinson, J. W., et al. Male mice with elevated c-type natriuretic peptide-dependent guanylyl cyclase-b activity have increased osteoblasts, bone mass and bone strength. Bone. 135, 115320 (2020).
