Здесь мы представляем протокол, демонстрирующий использование гидрогеля в качестве трехмерного (3D) каркаса клеточной культуры для культивирования стволовых клеток жировой ткани (ADSC) и внедрение фотобиомодуляции (PBM) для усиления пролиферации ADSC в условиях 3D-культуры.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Трехмерная клеточная культура стволовых клеток жировой ткани в гидрогеле с фотобиомодуляционной аугментацией
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Стволовые клетки, полученные из жировой ткани (ADSC), обладающие мультипотентными мезенхимальными характеристиками, близкими к стволовым клеткам, часто используются в регенеративной медицине из-за их способности к разнообразному диапазону клеточной дифференцировки и их способности усиливать миграцию, пролиферацию и смягчать воспаление. Тем не менее, ADSC часто сталкиваются с проблемами выживания и приживления в ранах, в первую очередь из-за неблагоприятных воспалительных условий. Для решения этой проблемы были разработаны гидрогели для поддержания жизнеспособности ADSC в ранах и ускорения процесса заживления ран. В данной работе мы поставили перед собой цель оценить синергетическое влияние фотобиомодуляции (ФБМ) на пролиферацию и цитотоксичность ADSC в рамках 3D-клеточной культуры. Иммортализированные АЦП высевали в гидрогели по 10 мкл плотностью 2,5 х 103 клетки и подвергали облучению с использованием диодов 525 нм и 825 нм при флюенциях 5 Дж/см2 и 10 Дж/см2. Морфологические изменения, цитотоксичность и пролиферацию оценивали через 24 ч и 10 дней после воздействия ПБМ. ADSC имели округлую морфологию и были рассеяны по всему гелю в виде отдельных клеток или сфероидных агрегатов. Важно отметить, что как PBM, так и 3D-культуральный каркас не оказывали цитотоксического воздействия на клетки, в то время как PBM значительно увеличивал скорость пролиферации ADSC. В заключение, это исследование демонстрирует использование гидрогеля в качестве подходящей 3D-среды для культуры ADSC и представляет PBM в качестве важной стратегии аугментации, в частности, для решения проблемы медленной скорости пролиферации, связанной с 3D-культурой клеток.
Введение
ADSC представляют собой мезенхимальные мультипотентные клетки-предшественники, обладающие способностью к самообновлению и дифференцировке в несколько клеточных линий. Эти клетки могут быть получены из стромально-васкулярной фракции (SVF) жировой ткани во время процедуры липоаспирации1. ADSC стали идеальным типом стволовых клеток для использования в регенеративной медицине, потому что эти клетки многочисленны, минимально инвазивны для сбора, легко доступны и хорошо охарактеризованы2. Терапия стволовыми клетками предлагает возможный путь к заживлению ран путем стимуляции миграции клеток, пролиферации, неоваскуляризации и у....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
ПРИМЕЧАНИЕ: См. Таблицу материалов для получения подробной информации, относящейся ко всем материалам, реагентам и программному обеспечению, используемым в этом протоколе. Протокол графически представлен на рисунке 1.
1. Двумерная (2D) клеточная культура
ПРИМЕЧАНИЕ: Иммортализированные ADSC (1 x106 клеток) хранятся при температуре -195,8 °C в жидком азоте в криоконсервационном флаконе, содержащем 1 мл среды для замораживания клеток.
- Подготовка 2D-среды для восстановления клеток и 2D-колбы для культивирования
- Перелейте 39 м....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Для оценки морфологии и визуального осмотра плотности клеток гидрогелей использовали обратную микроскопию (рис. 2). ADSC сохраняли округлую морфологию через 24 ч после посева и воздействия PBM. Клетки были разбросаны по всему гелю в виде одиночных клеток или в виноградоподобных кластерах. Морфология не изменялась через 10 дней в 3D-культуре. Не было отмечено окончательных различий в морфологии между экспериментальными и контрольными группами, а также между различными экспериментальными групп.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
ADSC являются идеальным типом клеток для использования в регенеративной медицине, поскольку они стимулируют различные процессы, способствуя заживлению ран 3,4. Тем не менее, существует ряд проблем, которые необходимо обойти, например, низкая выживаемость и неэффективное приживление клеток в месте повреждения9. Иммортализированные клетки использовались в качестве коммерчески доступной клеточной линии, поскольку они могут пассировать в течен.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторы заявляют об отсутствии конкурирующих интересов.
Благодарности
Это исследование финансировалось Национальным исследовательским фондом Южной Африки Thuthuka Instrument, грант No TTK2205035996; Департамент науки и инноваций (DSI) профинансировал Африканский лазерный центр (ALC), грант номер HLHA23X задание ALC-R007; Научно-исследовательский совет университета, номер гранта 2022URC00513; Южноафриканская инициатива по созданию научно-исследовательских кафедр Министерства науки и технологий (DST-NRF/SARChI), номер гранта 98337. Финансирующие организации не играли никакой роли в разработке исследования, сборе, анализе, интерпретации данных или написании рукописи. Авторы благодарят Университет Йоханнесбурга (UJ) и Лазерный исследователь....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| 525 нм диодный лазер | Национальный лазерный центр Южной Африки | EN 60825-1:2007 | |
| 825 нм диодный лазер | Национальный лазерный центр Южной Африки | SN 101080908ADR-1800 | |
| 96 луночных стрип-пластин | Sigma-Aldrich | BR782301 | |
| амфотерицин B | Sigma-Aldrich | A2942 | антибиотик (0,5%; 0,5 мл) |
| CellTiter-Glo 3D жизнеспособность клеток Анализ | Promega | G9681 | Реактив АТФ, Набор для анализа пролиферации |
| Corning 2 мл Наружный резьбовой полипропилен Криогенный флакон | Corning | 430659 | криовиальный |
| CryoSOfree | Sigma-Aldrich | C9249 | Клеточная замораживающая среда |
| CytoTox96 Нерадиоактивный анализ цитотоксичности | Promega | G1780 | Реактив цитотоксичности |
| Dulbecco' s Модифицированный Eagle Media | Sigma-Aldrich | D5796 | Базальная среда (39 мл/44 мл) |
| Лазерный измеритель мощности FieldMate | Coherent | 1098297 | |
| плоскодонный Corning 96 хорошо прозрачная полистирольная пластина | Sigma-Aldrich | CLS3370 | |
| Фетальная бычья сыворотка | Biochrom | S0615 | Обогащение питательной среды (5 мл; 10% / 10 мл; 20%) |
| Сбалансированный солевой раствор Хэнкса (HBSS) | Sigma-Aldrich | H9394 | Раствор для полоскания |
| Heracell 150i CO2 инкубатор | Thermo Scientific | 51026280 | |
| Heraeus Labofuge 400 | Thermo Scientific | 75008371 | Спиннер для 96 луночных планшетов |
| Heraeus Megafuge 16R центрифуга | ThermoFisher | 75004270 | |
| Immortalized ADSCs | ATCC | ASC52Telo hTERT, ATCC SCRC-4000 | Passage 37 |
| Invitrogen Countess 3 | Invitrogen | AMQAX2000 | Автоматизированный счетчик ячеек для Trypan Blue |
| Julabo TW20 водяная баня | Sigma-Aldrich | Z615501 | водяная баня используется для нагрева среды до 37 градусов; C |
| Olympus CellSens Entry | Olympus | версии 3.2 (23706) | Программное обеспечение для обработки изображений: получение цифровых изображений |
| Olympus CKX41 | Olympus | SN9B02019 | Микроскоп с инвертированным светом |
| Olympus SC30 Фотоаппарат | Olympus | SN57000530 | Камера, прикрепленная к микроскопу с инвертированным светом |
| Непрозрачные стенки Corning 96 лунок твердые полистирольные микропластины | Sigma-Aldrich | CLS3912 | Opaque хорошо используемые для люминесценции АТФ |
| Пенициллин-стрептомицин | Sigma-Aldrich | P4333 | Антибиотик (0,5%; 0,5 мл) |
| SigmaPlot 12.0 | Программное обеспечение Systat Incorporated | ||
| TrueGel3D – True3 | Sigma-Aldrich | TRUE3-1KT | 10 & L |
| TrueGel3D Ферментативный раствор для восстановления клеток | Sigma-Aldrich | TRUEENZ | 01:20 |
| Трипановый синий краситель | Thermo Fisher - Invitrogen | T10282 | 0,4% раствор |
| TrypLE Select Enzyme (1x) | Gibco | 12563029 | Раствор для отслоения клеток |
| Виктор Ниво Планшетный ридер | Perkin Elmer | HH3522019094 | Спектрофотометрический планшетный ридер |
Ссылки
- Zuk, P. A., et al. Multilineage cells from human adipose tissue: Implications for cell-based therapies. Tissue Eng. 7 (2), 211-228 (2001).
- Yuan, X., et al. Strategies for improving adipose-derived stem cells for tissue regeneration. ....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
