Fissiongær bruges her som en heterolog vært til at udtrykke bakterielle cytoskeletale proteiner såsom FtsZ og MreB som translationelle fusionsproteiner med GFP for at visualisere deres polymerisation. Også forbindelser, der påvirker polymerisation, identificeres ved billeddannelse ved anvendelse af et fluorescensmikroskop.
Bakterielle cytoskeletale proteiner såsom FtsZ og MreB udfører væsentlige funktioner såsom celledeling og vedligeholdelse af celleform. Desuden har FtsZ og MreB vist sig at være vigtige mål for ny antimikrobiel opdagelse. Flere assays er blevet udviklet til at identificere forbindelser rettet mod nukleotidbinding og polymerisering af disse cytoskeletale proteiner, primært fokuseret på FtsZ. Desuden er mange af analyserne enten besværlige eller omkostningsintensive, og det kræver ofte flere metoder at fastslå, om disse proteiner er lægemidlets cellulære mål. Endelig udgør lægemidlernes toksicitet for eukaryote celler også et problem. Her beskriver vi et enkelttrins cellebaseret assay for at opdage nye molekyler rettet mod bakterielt cytoskelet og minimere hits, der kan være potentielt giftige for eukaryote celler. Fissiongær er modtagelig for skærme med høj kapacitet baseret på mikroskopi, og en visuel skærm kan let identificere ethvert molekyle, der ændrer polymerisationen af FtsZ eller MreB. Vores analyse bruger standard 96-brøndpladen og er afhængig af de bakterielle cytoskeletale proteiners evne til at polymerisere i en eukaryot celle såsom fissionsgæren. Mens protokollerne beskrevet her er til fissionsgær og bruger FtsZ fra Staphylococcus aureus og MreB fra Escherichia coli, kan de let tilpasses andre bakterielle cytoskeletale proteiner, der let samles i polymerer i enhver eukaryot ekspressionsvært. Den metode, der beskrives her, skal bidrage til at lette yderligere opdagelse af nye antimikrobielle stoffer rettet mod bakterielle cytoskeletale proteiner.
Den udbredte resistens over for næsten alle antibiotika, der i øjeblikket anvendes til bekæmpelse af bakterielle infektioner, har skabt et øjeblikkeligt behov for nye kategorier af antibiotika. En rapport fra 2019 viste, at antibiotikaresistente infektioner resulterede i tab af 1.27 millioner liv, hvilket bidrog til en samlet optælling på 4.95 millioner dødsfald, når man overvejer komplikationer fra resistente bakterielle infektioner1. Selvom det stadig er effektivt i klinisk praksis, er det nuværende arsenal af antibiotika overvejende rettet mod et smalt spektrum af cellulære processer, primært med fokus på cellevæg, DNA og proteinsyntese. I løbet af det sidste halve århundrede er færre end 30 proteiner blevet udnyttet kommercielt som mål for udviklingen af nye antibakterielle midler 2,3. Denne begrænsede række levedygtige mål skaber betydelige begrænsninger for opdagelse af nye antibiotika eller derivater heraf til bekæmpelse af antibiotikaresistente bakterier. For at overvinde det nye problem med antibiotikaresistens er der derfor behov for udvikling af nye antibiotika med nye mål og virkningsmekanismer.
Et antibakterielt mål bør ideelt set være en væsentlig bestanddel af bakteriel cellevækst, bevares i hele de fylogenetisk forskellige arter, vise mindst eukaryot homologi og være tilgængelig for antibiotika4. Siden opdagelsen af bakterielle cytoskeletale proteiner, der er involveret i celledeling og vedligeholdelse af celleform, har de vist sig at være et lovende omdrejningspunkt for udvikling af antibakterielle forbindelser5. Disse proteiner er afgørende for bakteriel levedygtighed og spiller en afgørende rolle i opretholdelsen af celleform (MreB, CreS), division (FtsZ, FtsA) og DNA-adskillelse (ParM, TubZ, PhuZ, AlfA), beslægtet med cytoskelettet i eukaryote celler. Især udviser FtsZ et bemærkelsesværdigt højt bevaringsniveau på tværs af en bred vifte af prokaryote organismer, mens MreB findes i næsten alle stavformede bakterier. En sådan bred fordeling og relevans i cellelevedygtighed gør disse proteiner til et fascinerende mål i antibiotikaforskning 5,6,7.
Det er afgørende at vedtage en flerstrenget tilgang, der kombinerer in vivo-observationer, in vitro-interaktioner og enzymatiske eksperimenter for grundigt at validere bakterielle cytoskeletproteiner som det primære mål for en potentiel hæmmer7. Besværlige procedurer eller betydelige omkostningsimplikationer belaster mange tilgængelige analyser til dette formål. Disse er bemærkelsesværdige hindringer for deres udbredte anvendelse i screening af blyforbindelser, der kan påvirke det bakterielle cytoskelet. Blandt disse skiller mikroskopi sig ud som en usædvanlig effektiv og hurtig metode til vurdering af effektiviteten af forbindelser ved direkte at undersøge ændringer i cellemorfologi. Alligevel gør hetero-associeringen af målprotein med andre cytoskeletkomplekser, indirekte virkninger på grund af binding uden for målet og ændringer i membranpotentiale, vanskeligheder med at trænge effektivt ind i cellen og tilstedeværelse af effluxpumper, især i gramnegative bakterier, det kollektivt komplekst at lokalisere den nøjagtige årsag til bakteriel celledeformation 8,9,10.
Schizosaccharomyces pombe, eller fissionsgær som det er almindeligt kendt, er en stangformet encellet eukaryot organisme. Fissiongær anvendes i vid udstrækning som modelorganisme i cellulær og molekylærbiologi på grund af den ekstraordinære bevarelse i cellulære processer såsom cellecyklus og deling, cellulær organisation og kromosomreplikation med højere eukaryoter, herunder mennesker11,12. Desuden udtrykte Errington og kolleger et pollokaliseret bakterielt cytoskeletalt protein DivIVA i fissionsgær for at demonstrere, at DivIVA akkumulerede på negativt buede overflader13. Igen havde Balasubramanian og gruppe først etableret fissionsgær som et cellulært modelsystem for at bringe ny indsigt i mekanismen, samlingen og dynamikken af E. coli actin cytoskeletproteinet som MreB14 og tubulin homolog FtsZ15. De demonstrerer også A22’s evne til effektivt at hindre polymerisationen af MreB gennem epifluorescensmikroskopi, når den udtrykkes i gær14. Efter dette har andre grupper også med succes anvendt fissionsgær til at studere samlingsegenskaberne af chloroplast FtsZ1 og FtsZ2 proteiner16. For nylig har vi etableret et proof-of-concept for levedygtigheden af brugen af fissionsgær som en cellulær platform til specifikt at screene for bakterielle cytoskelethæmmere ved at foretage en omfattende vurdering af virkningen af tre kendte FtsZ-hæmmere-sanguinarine-, berberine- og PC190723-on FtsZ-proteiner afledt af to patogene bakterier, nemlig Staphylococcus aureus og Helicobacter pylori17. Derudover viser dette enkelttrins cellebaserede assay sig medvirkende til at minimere risikoen for at identificere forbindelser, der kan være potentielt giftige for eukaryote celler.
I denne rapport, ved hjælp af fissionsgærsystemet, foreslår vi en systematisk arbejdsgang ved hjælp af standard 96-brøndpladen til halvautomatisk screening og kvantificering af effekten af små molekylehæmmere rettet mod FtsZ fra Staphylococcus aureus og MreB fra Escherichia coli. Her opsætter og optimerer vi det semiautomatiserede workflow ved hjælp af de etablerede inhibitorer PC190723 og A22, der specifikt er målrettet henholdsvis FtsZ og MreB. Denne arbejdsgang bruger et epifluorescensmikroskop udstyret med et motoriseret højpræcisionstrin og automatiseret billedoptagelse i en standard 96-brøndplade for at forbedre den nuværende standardisering. Derfor kan det anvendes på mellemstore såvel som high-throughput skærme af syntetiske kemiske biblioteker og omgå nogle af de udfordringer, der er anført ovenfor.
Antimikrobiel resistens (AMR) er en alvorlig global sundhedstrussel, og der er et presserende behov for nye antibiotika med nye mål. Det bakterielle cytoskelet har vist sig at være et attraktivt mål for udvikling af nye antibiotika med små molekylehæmmere af celledelingsproteinet FtsZ, såsom TXA709, allerede i fase I kliniske forsøg30. Flere metoder er blevet udviklet til at identificere hæmmere af FtsZ-polymerisation 7,31. Vi har …
The authors have nothing to disclose.
SMP, SR og AKS anerkender stipendierne modtaget fra National Institute of Science Education and Research, Institut for Atomenergi. RS anerkender intramural finansieringsstøtte fra Institut for Atomenergi, og dette arbejde understøttes gennem en forskningsbevilling til RS (BT/PR42977/MED/29/1603/2022) fra Institut for Bioteknologi (DBT). Forfatterne anerkender også V Badireenath Konkimalla for hans kommentarer, forslag og diskussioner gennem hele udviklingen af protokollen.
96 Well CC2 Optical CVG Sterile, w/Lid. Black | Thermo Scientific™ | 160376 | |
96-well plate | Corning | CLS3370 | |
A22 Hydrochloride | Sigma | SML0471 | Dissolved in DMSO |
Adenine | FormediumTM | DOC0229 | 225 mg/L of media |
Concanavalin A | Sigma | C5275-5MG | |
DMSO | Sigma | 317275 | |
Edinburg minimal medium (EMM Agar or EMM Broth) | FormediumTM | PMD0210 | See below for composition |
EDTA | Sigma | EDS-500G | |
epMotion® 96 with 2-position slider | Eppendorf | 5069000101 | |
Histidine | FormediumTM | DOC0144 | 225 mg/L of media |
Leica DMi8 inverted fluorescence microscope | Leica Microsystems | German company | |
Leucine | FormediumTM | DOC0157 | 225 mg/L of media |
Lithium acetate | Sigma | 517992-100G | |
PC190723 | Merck | 344580 | Dissolved in DMSO |
Polyethylene glycol (PEG) | Sigma | 202398 | |
Thiamine | Sigma | T4625 | Filter sterilised |
Tris-Hydrochloride | MP | 194855 | |
Uracil | FormediumTM | DOC0214 | 225 mg/L of media, Store solution at 36°C |
YES (Yeast extract + supplements) Agar | FormediumTM | PCM0410 | See below for composition |
YES (Yeast extract + supplements) Broth | FormediumTM | PCM0310 | See below for composition |
Yeast (S. pombe) media | |||
Yeast extract + supplements (YES) | |||
Composition | g/L | ||
Yeast extract | 5 | ||
Dextrose | 30 | ||
Agar | 17 | ||
Adenine | 0.05 | ||
L-Histidine | 0.05 | ||
L-Leucine | 0.05 | ||
L-Lysine HCl | 0.05 | ||
Uracil | 0.05 | ||
Edinburg minimal medium (EMM) | |||
Composition | g/L | concentration | |
potassium hydrogen phthallate | 3 | 14.7mM | |
Na2HPO4 | 2.2 | 15.5 mM | |
NH4Cl | 5 | 93.5 mM | |
glucose | 2% (w/v) or 20 g/L | 111 mM | |
Salts (stock x 50) | 20 mL/L (v/v) | ||
Vitamins (stock x 1000) | 1 mL/L (v/v) | ||
Minerals (Stock x 10,000) | 0.1 mL/L (v/v) | ||
Salts x 50 | 52.5 g/l MgCl2.6H20 (0.26 M) | 52.5 | 0.26 M |
0.735 mg/l CaCl2.2H20 (4.99 mM) | 0.000735 | 4.99 mM | |
50 g/l KCl (0.67 M) | 50 | 0.67 M | |
2 g/l Na2SO4 (14.l mM) | 2 | 14.1 mM | |
Vitamins x 1000 | 1 g/l pantothenic acid | 1 | 4.20 mM |
10 g/l nicotinic acid | 10 | 81.2 mM | |
10 g/l inositol | 10 | 55.5 mM | |
10 mg/l biotin | 0.01 | 40.8 µM | |
Minerals x 10,000 | boric acid | 5 | 80.9 mM |
MnSO4 | 4 | 23.7 mM | |
ZnSO4.7H2O | 4 | 13.9 mM | |
FeCl2.6H2O | 2 | 7.40 mM | |
molybdic acid | 0.4 | 2.47 mM | |
KI | 1 | 6.02 mM | |
CuSO4.5H2O | 0.4 | 1.60 mM | |
citric acid | 10 | 47.6 mM | |
Strains/ Plasmids | |||
Strains | Description | Reference | |
CCD190 | Escherichia coli DH10β | Invitrogen | |
CCDY4 | MBY3532; CCDY346/pREP42- GFP-EcMreB | Srinivasan et al., 2007 | |
CCDY340 | CCDY346/pREP42- SaFtsZ-GFP | Sharma et al., 2023 | |
CCDY346 | MBY192; Schizosaccharomyces pombe [ura4-D18, leu1-32, h-] | Dr. Mithilesh Mishra (DBS, TIFR) | |
Plasmids | |||
pCCD3 | pREP42-GFP-EcMreB | Srinivasan et al., 2007 | |
pCCD713 | pREP42-SaFtsZ-GFP | Sharma et al., 2023 |