Denne artikel beskriver en protokol til aggregering og indkapsling af miltceller i en halvfast kældermembranmatrix. Kældermembranmatrixkonstruktioner kan anvendes i tredimensionel kultur til undersøgelse af organoidudvikling eller til in vivo-transplantation og vævsregenereringsundersøgelser.
Milten er et immunorgan, der spiller en central rolle i blodbårne immunresponser. Det anatomiske eller funktionelle tab af dette væv øger modtageligheden for alvorlige blodinfektioner og sepsis. Autotransplantation af miltskiver er blevet brugt klinisk til at erstatte tabt væv og genoprette immunfunktionen. Imidlertid er mekanismen, der driver robust og immunologisk funktionel miltvævsregenerering, ikke blevet fuldt belyst. Her sigter vi mod at udvikle en metode til aggregering og indkapsling af miltceller i en halvfast matrix for at undersøge de cellulære behov for miltvævsdannelse. Kældermembranmatrixindkapslede cellekonstruktioner er modtagelige for både in vitro-vævskultur af tredimensionelle organoider såvel som transplantation under nyrekapslen for direkte at vurdere in vivo-vævsdannelse. Ved at manipulere inputcellerne til aggregering og indkapsling demonstrerer vi, at transplantatafledte PDGFRβ+MAdCAM-1– neonatale stromale celler er nødvendige for miltvævsregenerering under dyretransplantationsmodeller.
Traumatisk brud på milten og udseendet af flere miltknuder i kroppen var en af de første indikationer på, at miltvæv havde regenerativ kapacitet 1,2. Miltautotransplantationer blev senere introduceret i klinikken for at bevare miltvæv hos patienter, der kræver akut splenektomi3. På trods af at det har været en del af klinisk praksis i årtier, er der meget lidt kendt om, hvordan milten regenererer. Dyretransplantationsmodeller har givet indsigt i flere parametre for miltregenerering og immunfunktion 4,5. Især har eksperimentelle modifikationer af transplantatpræparationsmetoden gjort det muligt at undersøge vævsregenerering mere detaljeret på cellulært og molekylært niveau.
Transplantationer, der involverer hele miltskiver, gennemgår en fase med massenekrose, før en ny miltstruktur genopbygges6. Den indledende fase af transplantannekrose tyder på, at hovedparten af transplanteret væv stort set består af røde og hvide blodlegemer og er unødvendig for miltregenerering. Dette blev undersøgt eksperimentelt ved at udelukke hæmatopoietiske celler fra milttransplantater før transplantation under musens nyrekapsel. Her viste miltens ikke-leukocyt/ikke-erytrocytfraktion, som omfatter stromale og endotelceller, sig at være tilstrækkelig til at inducere de novo vævsdannelse7. Miltstromalvæv kunne yderligere behandles til en enkeltcellesuspension, hvilket muliggør anvendelse af cellesorteringsteknologier til at manipulere cellulær transplantatsammensætning. Ved selektivt at fjerne kandidatcelletyper blev der identificeret to CD45-TER-119-stromale cellepopulationer, der var uundværlige for transplantatudvikling: en endotellignende CD31+CD105+MAdCAM-1+ cellepopulation og en mere bredt defineret PDGFRβ+ mesenkymalcellepopulation8.
Konstruktionen af transplantater fra miltceller varierer med hensyn til støttematerialer og cellebelastningsprocesser. Milt fremstillet ud fra manipuleret væv er tidligere blevet fremstillet ved at lægge miltenheder på et polyglykolsyre/poly-L mælkesyrepolymerstillads 5,9. Interessant nok kunne miltstromale celler absorberet i en kollagensvamp ikke indpodes, mens stromale celler aggregeret og indlæst over et kollagenark lettede miltregenerering8. Resuspensionen af miltstromale celler inde i en Matrigel-matrix har også vist sig at inducere celleaggregering under tredimensionelle kulturbetingelser10. Denne metode er dog ikke testet til brug i transplantationsmodeller. Det overordnede mål med den nuværende protokol er at tvangsaggregere og indkapsle miltstromale celler direkte i kældermembranmatrixen, som efterfølgende kan overføres til et tredimensionelt in vitro-vævskultursystem eller anvendes som et køretøj til dyremodeltransplantationer (supplerende figur 1).
Aggregeringen af neonatale miltceller inde i et halvfast medium repræsenterer en levedygtig metode til generering af miltkonstruktioner. Lignende kældermembranmatrixbaserede protokoller er blevet brugt til at initiere tredimensionelle miltkulturer10. Her demonstrerer vi, at miltkonstruktioner er lige så modtagelige for in vitro organoidkultursystemer såvel som in vivo-transplantationsmodeller . Det skal bemærkes, at transplantationen af in vitro-dyrkede miltorganoid…
The authors have nothing to disclose.
Denne forskning blev støttet af National Health and Medical Research Council of Australia (#GNT1078247).
96 Well Polypropylene 1.2 mL Cluster Tubes | Corning | CLS4401 | For placing inside a 14 ml conical tube |
B-mercaptoethanol | Gibco | 21985023 | Stock 55 mM, use at 50 uM |
Collagenase D | Roche | 11088858001 | |
Collagenase IV | Sigma-Aldrich | C5138 | From Clostridium histolyticum |
Deoxyribonuclease I (DNase I) | Sigma-Aldrich | D4513 | Deoxyribonuclease I from bovine pancreas,Type II-S, lyophilized powder, Protein ≥80 %, ≥2,000 units/mg protein |
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM) | Sigma-Aldrich | D5796 | 4500 mg/L Glucose, L-Glutamine, and Sodium Bicarbonate, without Sodium Pyruvate, Liquid. Sterile Filtered. |
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (PBS) | Sigma-Aldrich | D8537 | Without calcium chloride and magnesium chloride, sterile-filtered |
Eclipse 200 μl Pipette Tips | Labcon | 1030-260-000 | Bevel Point |
Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | 26140-079 | Lot# 1382243 |
GlutaMAX | Gibco | 35050061 | Stock 100X, use at 1X |
Matrigel | Corning | 354263 | Matrigel matrix basement membrane High Concentration, Lot# 7330186 |
MEM Non-essential Amino Acids | Gibco | 11140076 | Stock 100X, use at 1X |
Penicillin/Streptomycin | Gibco | 15140122 | Stock 10,000 units/ml Penicillin, 10,000 ug/ml Streptomycin |
Reversible Cell Strainer | STEMCELL Technologies | 27216 | 70 μm |
Ring Tweezers | NAPOX | A-26 | Ring size: 3 mm |
Rock Inhibitor (Y-27632) | MedChemExpres | HY-10071 | |
Thermofisher Heraeus Megafuge 40R Centrifuge | Thermofisher | Acceleration and deceleration speeds were set to 8 | |
Ultra Fine Tweezers | EMS | 78340-51S | Style 51S. Antimagnetic/anti-acid SA low carbon austenitic steel tweezers are corrosion resistant. Anti-glare satin finish. |
Vicryl 5/0 Suture Ligapak Reel | Ethicon | J283G | |
Wiretrol II Long Wire Plunger | Drummond | 5-000-2002-L | Stainless Steel Plunger, 25 & 50 μL/WRTL II, Long |
Wound Clip Applier | MikRon | 427630 | |
Wound Clips | MikRon | 427631 | 9 mm |