由于人体组织获取受限，肌间脂肪组织（IMAT）的生物学特性在很大程度上尚未被探索。本文介绍了一种从冷冻的人类IMAT样本中分离细胞核并构建文库的详细方案，用于单细胞核RNA测序，以鉴定这一独特脂肪储存库的细胞组成。
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本文内容
摘要
摘要
肌间脂肪组织（IMAT）是一种相对研究较少的脂肪储存部位，位于肌纤维之间。IMAT 含量随年龄和体重指数（BMI）增加而升高，并与代谢性疾病及肌肉退行性疾病相关；然而，目前对 IMAT 的生物学特性及其与周围肌纤维相互作用的理解仍严重不足。近年来，单细胞和单细胞核 RNA 测序技术已为我们提供了多种人体组织的细胞类型特异性图谱。然而，由于人类活检样本获取的固有困难，人类 IMAT 的细胞组成在很大程度上仍未被探索。除了所获组织量有限外，人类 IMAT 的处理也因其紧邻骨骼肌组织和筋膜而变得复杂。脂肪细胞富含脂质的特性使其难以适用于单细胞分离。因此，单细胞核 RNA 测序是实现单细胞分辨率下高维转录组分析的最佳方法，有望揭示该脂肪库的生物学特性，包括 IMAT 精确的细胞组成。本文中，我们提供了一种针对冷冻人类 IMAT 进行细胞核分离及文库构建以开展单细胞核 RNA 测序的详细实验方案。该方案采用基于液滴的方法，可实现对数千个细胞核的分析，从而具备检测稀有及低丰度细胞类型的能力。
引言
肌间脂肪组织（IMAT）是一种异位脂肪储存库，位于肌纤维之间并环绕肌纤维分布1。正如Goodpaster等人近期综述中详细描述的那样，可利用高分辨率计算机断层扫描（CT）和磁共振成像（MRI）检测IMAT（图1A、B），其分布遍及全身各处的肌纤维周围及内部1。IMAT的含量在个体间差异显著，并受体重指数（BMI）、年龄、性别、种族和久坐行为等因素影响2,3,4。此外，在与肌肉退变相关的病理状态下常可观察到IMAT沉积5，大量研究已证实，肥胖、2型糖尿病、代谢综合征及胰岛素抵抗个体中IMAT质量增加6,7,8,9。然而，IMAT的细胞与生物学特性目前才刚刚开始被揭示。由于IMAT在体内的分布位置和含量存在较大变异，且获取难度较大，因此从这一独特的脂肪储存库中采集....
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方案
本方案所用样本来自肌肉、活动能力与衰老研究（Study of Muscle, Mobility, and Aging，SOMMA）15,，该研究已获得西方机构审查委员会-哥白尼集团（Western IRB-Copernicus Group，WCG）机构审查委员会批准，并遵循《赫尔辛基宣言》进行。所有参与者均签署了书面知情同意书，同意参与本研究。
注意：本方案改编自先前使用100 mg人腹部皮下脂肪组织在基于纳米孔板平台上的方案16。当前方案已优化，适用于50 mg人肌内脂肪组织（IMAT）的细胞核分离及基于液滴平台的文库制备。若需从非人类IMAT或其他脂肪组织库中分离细胞核，可能需要进一步优化本方案。
1. 缓冲液和试剂的配制（表1和表2）
注意：缓冲液需在实验当天新鲜配制，不可重复使用。
- 将离心机预冷至 4 °C。
- 准备匀浆缓冲液和细胞核分离介质。
- 准备两桶冰，并将 2 个 15 mL 圆锥形管预冷。
- 按照 表 1 中列出的顺序，在一个 15 mL 圆锥形管中混合匀浆缓冲液（HB）的所有试剂。....
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结果
本实验流程旨在指导处理冰冻的人类骨骼肌内脂肪组织（IMAT）样本，以获得单细胞核分辨率的基因表达谱，从而实现细胞类型的鉴定。此处展示的是来自SOMMA研究中一名参与者的代表性IMAT样本。
对snRNA-seq数据进行分析的第一步是评估数据质量，以识别低质量的细胞核，这些细胞核可能需要从数据集中剔除。重要的是，过滤步骤和阈值应根据手头样本类型和数据集的具体情况来确定，因为常用的评估指标在不同组织和细胞类型之间可能存在差异22,23。图4A展示了用于评估生成的snRNA-seq数据质量的一些关键指标。每个细胞核检测到的基因数量取决于测序深度和细胞类型，但对于高质量的细胞核，该数值通常应高于20018,23。使用本方案生成的数据处于预期范围内，共检测到4662个细胞核，每个细胞核中位基因数为11.......
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讨论
使用IMAT存在若干固有挑战。除了其可及性有限之外，样本材料的产量通常也非常稀少，且 "污染" 骨骼肌的污染几乎难以避免。为了获得最佳质量的样本，应在插入活检针时穿透肌筋膜（以确保不采集到皮下脂肪组织），并在取样后立即在显微镜下分离样本，尽可能去除多余的肌肉组织，随后进行 用于组织学处理、速冻等后续操作。这是首个前瞻性采集并从骨骼肌中分离出IMAT样本的方法。相比之下，以往关于IMAT的单核RNA测序（snRNA-seq）数据均来自含有已知脂肪浸润的骨骼肌活检组织混合样本的细胞核分离，而非单独的IMAT组织。
与皮下脂肪组织相比，心外膜脂肪组织（IMAT）的密度更高，因此在细胞核分离过程中对组织进行充分的粉碎至关重要，以释放出组织结构中的细胞核。粉碎不充分可能导致细胞核得率降低，这对于组织量有限的情况尤为不利。此外，准确计算所制备的细胞核悬液中的细胞核数量是关键步骤，以确保上样至芯片用于GEM生成的细胞核数量足够（但不过多）。细胞核过多，或存在较大的细胞核聚集体或碎片，可能导致堵塞，影响最终的cDNA浓度，并进而影响测序结果。在单细胞核制备过程中避免细胞核.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
作者谨此感谢科罗拉多大学的 Bryan Bergman 博士，为图 1C 中 MoTrIMAT 研究（R01AG077956）提供了 IMAT 活检图像。我们感谢肌肉、活动能力与衰老研究（Study of Muscle, Mobility and Aging）提供了代表性结果部分所展示数据所来源的 IMAT 样本。国家衰老研究所（NIA）资助了肌肉、活动能力与衰老研究（SOMMA；R01AG059416）及其附属研究 SOMMA AT（R01AG066474）和 SOMMA Knee OA（R01AG070647）。本研究的基础设施支持部分由匹兹堡大学（P30AG024827）和维克森林大学（P30AG021332）的 NIA Claude D. Pepper 老年美国人独立中心以及由国家转化科学促进中心资助的维克森林大学临床与转化科学研究所（UL1 TR001420）提供。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 0.2 µm Corning 注射器滤器 | Millipore Sigma | CLS431229 | |
| 1.7 mL DNA LoBind 管 | Eppendorf | 22431021 | 低吸附管 |
| 10% Tween 20 | Bio-Rad | 1662404 | |
| 100x 蛋白酶抑制剂 | Thermo Fisher Scientific | 78437 | |
| 10X 磁力分离器 | 10X Genomics | 230003 | |
| 10X 涡旋适配器 | 10X Genomics | 330002 | |
| 15 mL 标准锥形管 | Sarstedt | 6,25,54,502 | |
| 2100 Bioanalyzer | Agilent | G2939BA | |
| 50 mL 离心管 | Sarstedt | 6,25,47,254 | |
| CellRanger | Genomics | N/A | |
| Chromium iX 配件试剂盒 | 10X Genomics | PN1000323 | |
| Chromium iX 控制器 | 10X Genomics | PN1000326 | |
| Chromium Next GEM 芯片 G 单细胞试剂盒 | 10X Genomics | PN1000127 | |
| Chromium Next GEM 单细胞 3' 凝胶珠试剂盒 v3.1 | 10X Genomics | PN1000129 | |
| Chromium Next GEM 单细胞 GEM 试剂盒 v3.1 | 10X Genomics | PN1000130 | |
| Countess 3 自动细胞计数仪 | Thermo Fisher Scientific | AMQAX2000 | 自动细胞计数仪 |
| Countess 细胞计数板载玻片 | Thermo Fisher Scientific | C10228 | |
| DoubletFinder | R | N/A | |
| DPBS（无钙、无镁） | Thermo Fisher Scientific | 14190144 | |
| DTT | Thermo Fisher Scientific | R0861 | |
| 双索引试剂盒 TT A 套组，96 次反应 | 10X Genomics | PN1000215 | |
| Dynabeads MyOne SILANE | 10X Genomics | PN2000048 | |
| Falcon 100 µm 细胞筛 | Corning Life Science | 352360 | |
| Falcon 40 µm 细胞筛 | Corning Life Science | 352340 | |
| 甘油（甘油），50%（v/v）水溶液 | Ricca Chemical Company | 3290-32 | |
| KCl | Thermo Fisher Scientific | AM9640G | |
| 文库构建试剂盒 v3.1 | 10X Genomics | PN1000196 | |
| MACS SmartStrainer（30µm） | Miltenyi Biotec | 130-098-458 | |
| Mastercycler Nexus Gradient 梯度PCR仪 | Eppendorf | 6331000017 | |
| MgCl₂ | Ambion | AM9530G | |
| 研钵和研杵 | Health care logistics | 14075 | |
| NucBlue Live Ready Probes 染色试剂 | Thermo Fisher Scientific | R37605 | |
| 无核酸酶水（非DEPC处理） | Thermo Fisher Scientific | AM9930 | |
| Probumin 牛血清白蛋白（无脂肪酸），粉末 | Sigma-Aldrich | 820024 | |
| Qiagen Buffer EB | Qiagen | 19086 | |
| Ribolock RNase 抑制剂 | Thermo Fisher Scientific | EO0382 | |
| Seurat | R | N/A | |
| 蔗糖 | Sigma-Aldrich | S0389 | |
| SUPERasin 20 U/µL | Thermo Fisher Scientific | AM2695 | |
| ThermoMixer C | Eppendorf | 5382000015 | |
| 组织匀浆器 | Glass-Col | 099C K54 | |
| Tris 缓冲液 pH 8.0 | Thermo Fisher Scientific | AM9855G | |
| Triton X-100 | Thermo Fisher Scientific | AC327372500 | |
| UltraPure 0.5M EDTA pH 8.0 | Gibco | 15575020 |
参考文献
- Goodpaster, B. H., Bergman, B. C., Brennan, A. M., Sparks, L. M. Intermuscular adipose tissue in metabolic disease. Nat Rev Endocrinol. 19 (5), 285-298 (2023).
- Sparks, L. M., Goodpaster, B. H., Bergman, B. C. The metabolic significance of intermuscular adipos....
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