この論文は、原腸陥入マウス胚の単一細胞および核のシーケンシングのための高品質の単一細胞および核懸濁液のパイプラインを確立します。
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この記事について
サマリー
要約
過去10年間で、シングルセルアプローチは、遺伝子発現ダイナミクス、細胞の不均一性、およびサンプル内の細胞状態を研究するためのゴールドスタンダードになりました。シングルセルが進歩する前は、発生初期に動的な細胞状況と急速な細胞遷移を捉える可能性は限られていました。この論文では、原腸陥入の開始と完了に対応する、胚のE6.5日目からE8までのマウス胚の単一細胞および核分析を実行するための堅牢なパイプラインを設計しました。胃腸形成は、器官形成に不可欠な中胚葉、外胚葉、内胚葉の3つの胚葉を確立する発達中の基本的なプロセスです。野生型の腹陥陥胚に適用されたシングルセルオミクスに関する広範な文献が入手可能です。しかし、変異胚のシングルセル解析はまだ少なく、多くの場合、FACSで選別された集団に限定されています。これは、ジェノタイピングの必要性、時限妊娠、妊娠ごとに目的の遺伝子型を持つ胚の数、およびこれらの段階での胚あたりの細胞数に関連する技術的な制約に一部起因しています。ここでは、これらの制限を克服するために設計された方法論を示します。この方法は、望ましい遺伝子型との同期妊娠の可能性を高めるために、繁殖と時限妊娠のガイドラインを確立します。胚単離プロセスの最適化ステップと同日ジェノタイピングプロトコル(3時間)を組み合わせることで、微小液滴ベースのシングルセルを同日に実施することができ、細胞の高い生存率と堅牢な結果が保証されます。この方法には、胚からの最適な核単離のためのガイドラインがさらに含まれています。したがって、これらのアプローチは、原腸陥入期における変異胚のシングルセルアプローチの実現可能性を高めます。この方法により、突然変異が原腸の細胞ランドスケープをどのように形成するかの解析が容易になると期待しています。
概要
生殖は、正常な発達に必要な基本的なプロセスです。この急速でダイナミックなプロセスは、多能性細胞が臓器の形成方法を定義する系統特異的な前駆体に移行するときに発生します。長年にわたり、原腸陥入は、中胚葉、外胚葉、内胚葉の3つの大部分が均質な集団の形成と定義されてきました。しかし、高解像度技術と新たな数の胚性幹細胞モデル1,2により、初期の胚細胞層3,4の間に前例のない不均一性が明らかになりました。このことは、原腸の異なる細胞集団を調節するメカニズムについては、まだ解明されていないことがたくさんあることを示唆しています。マウスの胚発生は、原腸陥入中の初期の細胞運命決定を研究するための最良のモデルの1つです3,5。マウスの胃腸陥入は急速で、原腸陥入の全過程は胚の日E6.5からE85までの48時間以内に起こります。
近年のシングルセル技術の進歩により、野生型マウスの胚発生の詳細なマッピングが可能になり、原腸陥入中の胚の細胞および分子ランドスケープの包括的な概観が得られました
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プロトコル
このプロトコルおよび記載されているすべての動物実験は、正式に承認され、テンプル大学施設動物管理・使用委員会によって確立された施設ガイドラインに従っており、これはAssociation for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Careの国際ガイドラインに従っています。記載されているすべてのマウスは、C57/BL6Nバックグラウンド系統を使用していました。これらの研究では、動物の健康に関する懸念は観察されませんでした。
1.繁殖コロニーと時限妊娠
- 膣栓の視覚化により、妊娠の時間を計ります。プラグの日の正午はE0.5と見なされます。
- 欠けた広葉樹の寝具と紙の巣材を含む寝具材料を備えたケージ内のイエネズミ。
- 各ケージには、ネズミの餌、淡水、濃縮物(トンネルや巣材など)が含まれています。時間指定の繁殖中に毎日コロニー情報を追跡し、収集します。
- マウスの年齢、メスのマウスの妊娠数、オスのマウスが挿入したプラグの数、メスのマウスの発情期(図2)など、すべての情報を記録します。
注:すでに1〜2回出産した女性は、将来の妊娠でより大きな同腹児サイズを提供します。
- 時限妊娠を開始する前に、繁殖の1週間前に雄のマウ....
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結果
この論文で設計された方法論は、E6.5からE8までのシングルセルオミクス用の胚サンプルの調製を強化することを特に意図しています。この堅牢なパイプラインは、同期した妊娠、胚の分離、即日ジェノタイピング、細胞解離、細胞生存率の評価という5つの主要なステップで構成されています(図1A)。提示されたデータはE7からE7.5までの時点に焦点を当てていますが、手順にわずかなバリエーションがあるE8(図1B)までの胚にも適用できます(プロトコル全体の注を参照)。同期した時限妊娠は、2匹の雌マウスを雄のマウスと一緒にケージに入れることによって達成されました。膣栓は毎朝午前10時前にチェックされ、栓が観察された場合は、その日の正午までにE0.5と見なされました(図2A)。この研究では、プラグの最適な条件として、発情期または発情促進期の雌マウスを、以前の繁殖中に複数のプラグを成功裏に配置した履歴を持つ雄とペアにする必要がありました(図2B.......
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ディスカッション
この論文では、原腸陥入マウス胚から高品質の単一細胞および核懸濁液を得るための堅牢なパイプラインが紹介されており、特に初期発生における細胞運命の特異性メカニズムの研究を促進するために設計されています。この方法は、性別や体細胞遺伝子などの遺伝子型を必要とする胚の解析を最適化することにより、原腸陥入の分野における重大なギャップに対処します。このパイプラインは、遺伝子突然変異マウスモデルを利用し、マウス胚全体に対して高解像度のシングルセルシーケンシングを採用することにより、初期のマウス原腸の遺伝子発現プロファイルの理解を深めることができます。この方法は、Creリコンビナーゼシステムによる遺伝子変異マウスモデルを使用して、シングルセルオミクスの初期発生時点で高品質の細胞と核を得ることの実現可能性を示しています。この方法は、何度も試行を重ねて進化してきましたが、その間、サンプルはライブラリの調製とシーケンシングに必要な品質基準を満たしていませんでした。説明された方法論は、(1)胚の数を増やすための同期した時限妊娠、(2)凍結/融解を回避するための即日ジェノタイピング、(3)死にかけている細胞のシーケンシングを回避するための細胞/核の生存率の評価とい.......
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開示事項
著者は何も開示していません。
謝辞
Fox Chase Cancer CenterのGenomics Coreと、Dr. Johnathan Whetstineの研究室メンバーであるZach Gray氏、Madison Honer氏、Benjamin Ferman氏には、シーケンシング実験の技術サポートに感謝いたします。私たちは、Estaras博士と、シングルセル研究の初期分析に貢献したローテーション大学院生のAlex Morrisの研究室メンバーに感謝します。この研究は、NIHの助成金R01HD106969およびConchi EstarasへのR56HL163146によって資金提供されています。さらに、エリザベス・エイブラハムは、T32トレーニング助成金5T32HL091804-12の支援を受けました。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| 10 cmシャーレ | ジェネシーサイエンティフィック | 25-202 | |
| 1000 & マイクロ;L リーチ バリア チップ | ジェネシー サイエンティフィック | 23-430 | |
| 20 & マイクロ;Lリーチバリアチップ | ジェネシーサイエンティフィック | 24-404 | |
| 300 µLリーチバリアチップ | ジェネシーサイエンティフィック | 24-415 | |
| 37 µm リバーシブルストレーナー、小さな | 幹細胞 | 27215 | |
| 6 cm ペトリ皿 | ジェネシー・サイエンティフィック | 25-260 | |
| 8ストリップPCRチューブ | ジェネシー・サイエンティフィック | 27-125U | |
| アガロース | アペックス・バイオリサーチ 製品 | 20-102 | |
| ベンチマーク・サイエンティフィック BSH300 MyBlock ミニ・ドライバス | ジェネシー | 31-437 | |
| Benchmark Scientific Z216-MK Z216MK Hermle 冷蔵微量遠心分離機 | Genesee | 33-759R | |
| ウシ血清アルブミン (BSA) | Sigma-Aldrich | A2153 | |
| Chromium Controller | 10X | PN-1000127 | |
| Chromium Next GEM Single Cell 3' Reagent Kits v3.1 | 10X | PN-1000269 | |
| Countess 3 Automated Cell Counter | Invitrogen | ||
| Countess Cell Couning Chamber Slides | Invitrogen | C10283 | |
| D1000 Reagents | Agilent | 5067-5583 | |
| D1000 ScreenTape | Agilent | 5067-5582 | |
| Digitonin | ThermoFisher Scientific | BN2006 | |
| DirectPCR 卵黄嚢 | Viagen | 201-Y | |
| ジチオスレイトール (DTT) | ThermoFisher Scientific | R0861 | |
| DNA LoBind Tube 1.5 mL | Eppendorf | 22431021 | |
| Dubecco's Modificiation of Eagle's Medium (DMEM, 1x) | CORNING | 10-013-CV | |
| Dulbecco's PBS | GenClone | 25-508 | |
| Dumont #5 Fine Forceps | Fine Science Tools | 11254-20 | |
| Dumont #5SF鉗子 | ファインサイエンスツール | 11252-00 | |
| エタノール | Koptec | V1401 | |
| EVOS M7000イメージングシステム | Invitrogen | AMF7000 | |
| ファインハサミ-シャープ | ファインサイエンスツール | 14060-11 | |
| GoTaq G2グリーンマスターミックス | プロメガ | M7823 | |
| フ鉗子 | ファインサイエンスツール | 11049-10 | |
| MgCl2 | ThermoFisher Scientific | AC223211000 | |
| MiniAmp Thermal Cycler | Applied Biosystems | A37834 | |
| NaCl | Fisher Chemical | S271-500 | |
| NextSeq 1000/2000 P2 Reagents (100 Cycles) v3 | Illumina | 20046811 | |
| NextSeq2000 | Illumina | ||
| ニコン SMZ 1000 実体顕微鏡 | ニコン | ||
| Nondiedt P40 | Sigma-Aldrich | 74385 | |
| ヌクレアーゼフリー 水 | GenClone | 25-511 | |
| 光学管 8x ストリップ (401428) | Agilent | 401428 | |
| 光学管キャップ 8x ストリップ (401425) | Agilent | 401425 | |
| ポセイドン 31-511、HS24 微量遠心分離機、1.5/2.0 mL ローター 24 個、遠心分離機/単位 | 1 個 ジェネシー | 31-511 | |
| プロテイナーゼ K | Sigma-Aldrich | P6556 | |
| 量子ビット dsDNA 定量アッセイキット | Invitrogen | Q32851 | |
| 量子ビット Flex 3 | Invitrogen | ||
| RNase 阻害剤 | フィッシャー・サイエンティフィック | 12-141-368 | |
| 標準パターン鉗子 | ファインサイエンスツール | 11000-12 | |
| テープステーションローディングのヒントア | ジレント | 5067-5598 | |
| テープステーション4150 | ジレント | G2992AA | |
| トリスHCL(Ph7) | 品質生物学的 | 351-007-101 | |
| パンブルーステイン0.4% | セロモフィッシャーサイエンティフィック | T10282 | |
| トライプルエクスプレス | Gibco | 12604-021 | |
| Tween-20 | Bio-Rad | 1662404 | |
| Vortex ミキサー IKA MS3 96 ウェルサンプルプレートアダプター | IKA | 3617000 |
参考文献
- Arias, A. M., Marikawa, Y., Moris, N. Gastruloids: Pluripotent stem cell models of mammalian gastrulation and embryo engineering. Dev Biol. 488, 35-46 (2022).
- Kim, Y., Kim, I., Shin, K. A new era of stem cell and developmental biolo....
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再版と許可
