אפיתל פיגמנט ברשתית (RPE) פועל כמחסום מכריע בין הכורואיד לרשתית, ומקדם את בריאותם ותפקודם של סוגי תאי רשתית, כגון פוטורצפטורים. במאמר זה אנו מתארים פרוטוקול פשוט ויעיל לבידוד וטיפוח RPE של מורין בוגר.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
שיטה פשוטה לבידוד ותרבית של תאי אפיתל פיגמנט ברשתית מעכברים בוגרים
במאמר זה
סיכום
תקציר
תאי אפיתל פיגמנט ברשתית (RPE) הם קריטיים לתפקוד תקין של הרשתית. תפקוד לקוי של RPE מעורב בפתוגנזה של מחלות רשתית חשובות, כגון ניוון מקולרי הקשור לגיל, רטיניטיס פיגמנטוזה ורטינופתיה סוכרתית. אנו מציגים גישה יעילה לבידוד RPE מעיניים בוגרות. בניגוד לשיטות שדווחו בעבר, גישה זו מאפשרת בידוד ותרבית של RPE טהור ביותר מעכברים בוגרים. שיטה פשוטה ומהירה זו אינה דורשת מיומנות טכנית נרחבת והיא ניתנת להשגה באמצעות כלים מדעיים בסיסיים וריאגנטים. RPE ראשוני מבודד מעכברי רקע C57BL/6 בגילאי 3 עד 14 שבועות על ידי שאיבה של העין ואחריה הסרת המקטע הקדמי. טריפסיניזציה אנזימטית וצנטריפוגה משמשים לניתוק ולבידוד RPE מכוס העין. לסיכום, גישה זו מציעה פרוטוקול מהיר ויעיל לניצול RPE בחקר תפקוד הרשתית ומחלות.
מבוא
אפיתל פיגמנט הרשתית (RPE) הוא חד-שכבתי תאי מיוחד המצפה את קרום ברוך הממוקם בין פוטורצפטורים לבין כורואיד1. תאי RPE ממלאים תפקיד קריטי בתפקוד תקין של הרשתית. תאי RPE מובילים גלוקוז וויטמין A לקולטני אור, מקדמים ראייה על ידי איזומריזציה מחדש של רשתית all-trans לתוך רשתית 11-cis ושומרים על מקטעים חיצוניים של photoreceptor באמצעות phagocytosis של מקטעים חיצוניים שנשפכו, להסיר מים מהחלל subretinal, ליצור את מחסום הדם-רשתית החיצוני באמצעות נוכחות של צמתים הדוקים להפריש גורמי גדילה נוירוטרופיים (כגון פיגמנט אפיתל נגזר פקטור, ו-Basic Fibroblast Growth Factor) התומכים בפוטורצפטורים2. תפקוד לקוי של תאי RPE מעורב בפתוגנזה של רטינו....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
השימוש בבעלי חיים במחקר זה אושר על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים (IACUC) של אוניברסיטת קייס ווסטרן ריזרב.
1. הכנת ריאגנטים
- הכינו את מדיום חיץ הכביסה על ידי השלמת תמיסת המלח המאוזנת של Hank (HBSS), ללא סידן, ללא מגנזיום, ללא פנול אדום עם תמיסת חיץ HEPES של 10 mM. יש לשמור את התמיסה בטמפרטורה של 4°C עד לשימוש.
- הכינו מדיום RPE על ידי השלמת מדיום הנשר המתוקן של Dulbecco עם 4.5 גרם / ליטר גלוקוז, תוסף גלוטמקס 1.25x (ריכוז מלאי 100x או 200 mM; ריכוז סופי של 2.5 mM L-גלוטמין), עם 10% נסיוב בקר עוברי, 1% פניצילין/סטרפטומיצין, ותמיסת חומצות אמינו לא חיוניות 1x MEM (100x). לפני השימוש, לחמם מראש את ה....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
הפרוטוקול המתואר שימש בעכברי רקע C57BL/6. נראה כי מגדר אינו משנה את היכולת לתרבות RPE. עכברים מתחת לגיל 6 שבועות מניבים יריעות RPE מוגבלות בהשוואה לעכברים מבוגרים, וייתכן שיהיה צורך ביותר עיניים כדי להגיע למפגש אופטימלי. לאחר הבידוד, לתאי RPE לוקח בערך 3 ימים להתייצב ולהתחבר לצלחת תרבית התא. כ-24 שעות לאחר הבידוד, תאים עגולים ופיגמנטיים שנראים אנוקלאט החלו לשקוע אך לא נצמדו באופן מלא לצלחת (איור 1A). במהלך 48-72 השעות הבאות, התאים מתחילים להיצמד ולהתפשט תוך שמירה על פיגמנטציה כהה וגרעין שקוף.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
במאמר זה, תיארנו פרוטוקול פשוט לבידוד ולתרבית של אפיתל פיגמנט רשתית מורין. תאי RPE שבודדו מעיניהם של עכברים בוגרים ביטאו סמן ספציפי ל-RPE, RPE65, וסמן צומת בין-תאי, ZO-1. בנוסף, התאים בתרבית התפתחו ליריעות פיגמנטיות משושות בתרבית.
מספר שיטות לבידוד RPE במכרסמים פורסמו בעבר 6,7,8,9,10,11,12.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
אין גילויים כספיים או לא פיננסיים רלוונטיים.
תודות
המחקר שדווח בפרסום זה נתמך על ידי NIH Grants R01EY018341 and R01EY019250 (C.S.S.), NIH Grant F31EY035156 (A.H.) ו-P30 EY011373. לארגון המממן לא היה כל תפקיד בעיצוב המחקר או בניהולו.
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| 0.009 RD Single-Edge Blades | Personna | 941202 | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) | Corning | 10-013-CV | עם 4.5 גרם/ליטר גלוקוז, L-גלוטמין, סודיום פירובט |
| סרום בקר עוברי | Corning | 35010CV | |
| GlutaMAX, 100x | Gibco | 35050061 | |
| Hank's Balanced Salt Solution | Gibco | 14175095 | ללא סידן, ללא מגנזיום, ללא פנול אדום |
| HEPES תמיסת חיץ (1M) | של Gibco | ||
| MEM, 100x | Gibco | 11140050 | |
| סכין מיקרו-Unitome | BVI Beaver | 377546 | |
| תמיסת פניצילין-סטרפטומיצין, 100x | Corning | 30-002-CI | |
| Microstyrene Microplates | Falcon | 08-772-1 | 24-well או 48-well |
| סרום בקר עוברי | רגיל קורנינג | 35-010-CV | |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | Gibco | 25200056 | עם פנול אדום |
| Vannas מספריים | Fine Science | Tools 10091-12 |
מקורות
- Strauss, O. The retinal pigment epithelium in visual function. Physiol Rev. 85 (3), 845-881 (2005).
- Lakkaraju, A., et al. The cell biology of the retinal pigment epithelium. Prog Retin Eye Res. 100846, (2020).
- Lambros, M. L., Plafker, S. M.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
