Retina pigment epiteli (RPE), koroid ve retina arasında çok önemli bir bariyer görevi görür ve fotoreseptörler gibi retina hücre tiplerinin sağlığını ve işlevini destekler. Burada, yetişkin murin RPE'yi izole etmek ve kültürlemek için basit ve etkili bir protokol açıklıyoruz.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Yetişkin Farelerden Retinal Pigment Epitel Hücrelerinin İzolasyonu ve Kültürü için Basitleştirilmiş Bir Yöntem
Bu makalede
Özet
Özet
Retina pigment epitel hücreleri (RPE), retinanın düzgün çalışması için kritik öneme sahiptir. RPE disfonksiyonu, yaşa bağlı makula dejenerasyonu, retinitis pigmentosa ve diyabetik retinopati gibi önemli retina hastalıklarının patogenezinde rol oynar. RPE'nin murin yetişkin gözlerinden izolasyonu için kolaylaştırılmış bir yaklaşım sunuyoruz. Daha önce bildirilen yöntemlerin aksine, bu yaklaşım yetişkin farelerden yüksek saflıkta RPE'nin izolasyonunu ve kültürünü mümkün kılar. Bu basit ve hızlı yöntem, kapsamlı teknik beceri gerektirmez ve temel bilimsel araçlar ve reaktiflerle elde edilebilir. Primer RPE, 3 ila 14 haftalık C57BL/6 arka plan farelerinden gözün enükleasyonu ve ardından ön segmentin çıkarılması ile izole edilir. Enzimatik tripsinizasyon ve santrifüjleme, RPE'yi vizör lastiğinden ayırmak ve izole etmek için kullanılır. Sonuç olarak, bu yaklaşım, retina fonksiyonu ve hastalığı çalışmasında RPE'nin kullanımı için hızlı ve etkili bir protokol sunmaktadır.
Giriş
Retina pigment epiteli (RPE), fotoreseptörler ve koroid1 arasında bulunan Bruch zarını kaplayan özel bir hücre tek tabakasıdır. RPE hücreleri, retinanın düzgün çalışmasında kritik bir rol oynar. RPE hücreleri, glikoz ve A vitaminini fotoreseptörlere taşır, all-trans retinalin 11-cis retinal içine yeniden izomerizasyonu ile görüşü teşvik eder ve dökülen dış segmentlerin fagositozu yoluyla fotoreseptörün dış segmentlerini korur, subretinal boşluktan suyu uzaklaştırır, sıkı bağlantıların varlığı yoluyla dış kan-retina bariyerini oluşturur ve nörotropik büyüme faktörleri salgılar (Pigment Epitel Türetilmiş Faktör gibi, ve Temel Fibroblast Büyüme F....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
Bu çalışmada hayvan deneklerin kullanımı, Case Western Reserve Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi (IACUC) tarafından onaylanmıştır.
1. Reaktiflerin hazırlanması
- Hank'in dengeli tuz çözeltisini (HBSS), kalsiyum içermez, magnezyum içermez, fenol kırmızısı içermez 10 mM HEPES tampon çözeltisi ile takviye ederek yıkama tamponu ortamı hazırlayın. Kullanana kadar çözeltiyi 4 ° C'de tutun.
- Dulbecco'nun Modifiye Eagle's Medium'unu 4.5 g/L glikoz, 1.25x GlutaMAX Takviyesi (stok konsantrasyonu 100x veya 200 mM; nihai konsantrasyon 2.5 mM L-glutamin), %10 fetal sığır serumu, %1 penisilin/stre....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Açıklanan protokol C57BL/6 arka plan farelerinde kullanılmıştır. Cinsiyet, RPE'yi kültürleme yeteneğini değiştirmiyor gibi görünmektedir. 6 haftadan küçük fareler, yaşlı farelere kıyasla sınırlı RPE tabakaları verir ve optimal birleşmeye ulaşmak için daha fazla göze ihtiyaç duyulabilir. İzolasyonu takiben, RPE hücrelerinin stabilize olması ve hücre kültürü plakasına bağlanması yaklaşık 3 gün sürer. İzolasyondan yaklaşık 24 saat sonra, anükleat gibi görünen yuvarlak, pigmentli hücreler yerleşmeye başlamış ancak plakaya ta.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Bu yazıda, murin retinal pigment epitelinin izolasyonu ve kültürü için basitleştirilmiş bir protokol özetledik. Yetişkin farelerin gözlerinden izole edilen RPE hücreleri, RPE'ye özgü bir belirteç olan RPE65 ve hücreler arası bir bağlantı belirteci olan ZO-1'i eksprese etti. Ek olarak, kültürlenmiş hücreler kültürde pigmentli, altıgen tabakalar halinde gelişti.
Kemirgenlerde RPE'nin izolasyonu için çeşitli yöntemler daha önce yayınlanmıştır 6,7,8,9,10,11,12.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
İlgili finansal veya finansal olmayan açıklama yoktur.
Teşekkürler
Bu yayında bildirilen araştırmalar NIH Grants R01EY018341 and R01EY019250 (CSS), NIH Grant F31EY035156 (AH) ve P30 EY011373 tarafından desteklenmiştir. Fon sağlayan kuruluşun bu araştırmanın tasarımında veya yürütülmesinde hiçbir rolü yoktu.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| 0.009 RD Tek Kenarlı Bıçaklar | Personna | 941202 | |
| Dulbecco'nun Modifiye Eagle's Medium (DMEM) | Corning | 10-013-CV | 4.5 g/L glikoz, L-glutamin, sodyum piruvat ile |
| Fetal sığır serumu | Corning | 35010CV | |
| GlutaMAX, 100x | Gibco | 35050061 | |
| Hank'in Dengeli Tuz Çözeltisi | Gibco | 14175095 | Kalsiyum yok, magnezyum yok, fenol kırmızısı |
| yok HEPES Tampon Çözeltisi (1M) | Gibco | 15630106 | |
| MEM Esansiyel Olmayan Amino Asitler, 100x | Gibco | 11140050 | |
| Mikro-Unitome Bıçağı | BVI Kunduz | 377546 | |
| Penisilin-Streptomisin Çözeltisi, 100x | Corning | 30-002-CI | |
| Polistiren Mikroplakalar | Falcon | 08-772-1 | 24 kuyulu veya 48 oyuklu |
| Düzenli Fetal Sığır Serumu | Corning | 35-010-CV | |
| Tripsin-EDTA (% 0.25) | Gibco | 25200056 | fenol kırmızısı |
| Vannas makas | ile Güzel Bilim Araçları | 10091-12 |
Kaynaklar
- Strauss, O. The retinal pigment epithelium in visual function. Physiol Rev. 85 (3), 845-881 (2005).
- Lakkaraju, A., et al. The cell biology of the retinal pigment epithelium. Prog Retin Eye Res. 100846, (2020).
- Lambros, M. L., Plafker, S. M.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
