Labeling stamcellen met fluorescente kleurstoffen voor niet-invasieve detectie met optische beeldvorming
Summary
Deze video toont technieken voor de etikettering van menselijke embryonale stamcellen en mesenchymale stamcellen met fluorescerende kleurstoffen. Deze techniek kan worden gebruikt voor een in-vivo volgen van getransplanteerde stamcellen met optische beeldvorming en voor histopathologisch correlaties met fluorescentie microscopie.
Abstract
Optische beeldvorming (OI) is een eenvoudige, snelle en goedkope tool voor in vivo monitoring van nieuwe stamceltherapieën. De techniek is gebaseerd op ex vivo etikettering van stamcellen met een fluorescerende kleurstof, latere intraveneuze injectie van de gelabelde cellen en visualisatie van hun accumulatie in specifieke doelorganen of pathologieën. De gepresenteerde techniek laat zien hoe we menselijke mesenchymale stamcellen (hMSC) label door eenvoudige incubatie met de lipofiele fluorescerende kleurstof DiD (C67H103CIN2O3S) en hoe we menselijke embryonale stamcellen (hESC) label met de FDA goedgekeurde fluorescerende kleurstof Indocyanine Green (ICG). De opname mechanisme is via de hechting en de verspreiding van de lypophilic kleurstof over de fosfolipide celmembraan bilaag. De etikettering rendement is meestal verbeterd als de cellen worden geïncubeerd met de kleurstof in serum-vrije media, in tegenstelling tot incubatie in serum-bevattende media. Bovendien is de toevoeging van de transfectie-agent protaminesulfaat verbetert aanzienlijk contrastmiddel opname.
Protocol
Discussion
OI is een relatief nieuwe beeldvormende techniek, gebaseerd op de detectie van fluorescentie. OI is zo gevoelig als radiotracer op basis van beeldvormende technieken, maar niet geassocieerd met een bestraling blootstelling. OI biedt een effectief middel van het bijhouden cellen niet-invasieve en herhaaldelijk, waardoor inzicht in cel migratie naar de beoogde locatie. Een belangrijke beperking van de techniek is de beperkte penetratie van fluorescerende probes in vivo. Zo, een tracer accumulatie in diepe weefsels, meer dan ongeveer 5-10 cm v…
Acknowledgements
Dit project werd ondersteund door een Leon J. Thal SEED subsidie van het California Institute voor regeneratieve geneeskunde. Tobias Henning werd gefinancierd door een Research beurs van de Duitse Research Association (DFG, HE 4578/1-2). Wij willen dankbaar Juanito Meneses te erkennen voor zijn advies over de cultuur van menselijke embryonale stamcellen.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Indocyanine Green (IR-125) | Reagent | Fisher Scientific | AC41254-1000 | |
| DMSO | Reagent | Sigma | D-2650 | |
| D-MEM High Glucose | Reagent | Sigma | D5648 | |
| Gelatin | Reagent | Sigma | G1890 | Dilute to final concentration of 0.1% in PBS |
| PBS, Mg and Ca free | Reagent | GIBCO | 14190-144 | |
| Trypsin-EDTA 0.05% | Reagent | Invitrogen | 25300-120 | |
| Trypsin-EDTA 0.25% | Reagent | Invitrogen | 25200-114 | |
| FCS, characterized | Reagent | Hyclone | SH30071.03 | |
| Cell Strainer (40 μm Nylon) | Reagent | BD Falcon | 352340 | |
| DiD | Reagent | Molecular Probes | V-22887 | |
| Knockout DMEM | Reagent | GIBCO | 10829018 | |
| Knockout Serum Replacer | Reagent | GIBCO | 10828028 | |
| b-Mercaptoethanol | Reagent | Sigma | 7522 | |
| Non-essential Amino Acids | Reagent | GIBCO | 11140050 | |
| FGF-2 | Reagent | R&D Systems | 233-FB-025 | |
| Glutamine 200mM | Reagent | GIBCO | 25030081 | |
| Penicillin/Streptomycin | Reagent | GIBCO | 15140-122 | |
| Protamine Sulfate | Reagent | American Pharmaceutical Partners Inc. |
References
- Daldrup-Link, H. E., Rudelius, M., Metz, S., Piontek, G., Settles, M., Pichler, B., Heinzmann, U., Weinmann, H. J., Schlegel, J., Link, T. M., Rummeny, E. J., Oostendorp, R. A. J. Stem cell tracking with Gadophrin-2 — a bifunctional contrast agent for MR imaging, optical imaging and fluorescence microscopy. Eur J Nucl Med Mol Imaging. 31, 1312-1321 (2004).
- Simon, G. H., Daldrup-Link, H. E., Kau, J., Metz, S., Schlegel, J., Piontek, G., Saborowski, O., Demos, S., Duyster, J., Pichler, B. J. Optical imaging of experimental arthritis using allogeneic leukocytes labeled with a near-infrared fluorescent probe. Eur J Nucl Med & Mol Imaging. 33, 998-1006 (2006).
- Sutton, E., Henning, T., Pichler, B., Bremer, C., Daldrup-Link, H. E. Cell Tracking with Optical imaging. Eur Radiol. 2, 350-357 (2003).
- Funovics, M. A., Alencar, H., Su, H. S., Khazaie, K., Weissleder, R., Mahmood, U. Miniaturized multichannel near infrared endoscope for mouse imaging. Mol Imaging. 2, 350-357 (2003).
