このビデオでは、蛍光色素を持つヒト胚性幹細胞と間葉系幹細胞のラベリングのテクニックを示しています。この手法は、生体内で光学イメージングを、蛍光顕微鏡による病理組織学的相関の移植された幹細胞の追跡に使用することができます。
このコンテンツを表示するには、JoVEへの購読が必要です。 または、無料トライアルをお申し込みください。
この記事について
サマリー
要約
光イメージング（OI）は、新しい幹細胞ベースの治療のin vivoモニタリングのための簡単、迅速かつ安価なツールです。技術は、蛍光色素、標識細胞と特定の標的臓器や病態におけるその蓄積の可視化のその後の静脈注射による幹細胞のex vivoでの標識に基づいています。紹介したテクニックは、我々は脂溶性蛍光色素を使って簡単なインキュベーションすることによりヒト間葉系幹細胞（hMSCの）ラベルを付ける方法を示していました（C67H103CIN2O3S）と我々はラベル付け方法FDAによるヒト胚性幹細胞（ヒトES細胞）蛍光色素はグリーン（ICG）をインドシアニン承認した。取り込み機構は、リン脂質の細胞膜の脂質二重層でlypophilic染料の付着と拡散を介してです。細胞を、血清含有培地でのインキュベーションとは対照的に無血清培地中の色素とインキュベートされている場合の標識効率は、通常、改善されています。さらに、トランスフェクション剤、硫酸プロタミンの添加は、造影剤の取り込みを大幅に向上させます。
プロトコル
蛍光色素との間葉系幹細胞のラベリングは、DID
- 間葉系幹細胞を標識するための手順を開始するには、トリプシン処理および細胞の定義の数と、懸濁液を得るために細胞を数える。
- インキュベーターから細胞を取り出し、ラベルを付ける細胞を含むフラスコから古い培地を吸引除去
- のMg / Caのフリー10mlのPBSで細胞を洗浄する。 PBSを吸引除去する。 MgおよびCaは、トリプシンを阻害する、従って私達はこれらなしでPBSを使用してください。
- 我々は5mlを使用するT75フラスコのために、予め温めておいた0.05％トリプシンを追加。フラスコの表面全体が覆われていることを確認してください。
- 約5分間37インキュベーターで℃でインキュベートする。
- 顕微鏡下で剥離を確認してください。細胞がまだフラスコに付着した場合、それを数回タップし、トリプシン処理が成功するまで少し長く待つ。
- 今、それは10％FCSを含有する培地を加えることによってトリプシンを中和する必要があります。トリプシンがあるので、我々はメディアの同じ量を使用してください。
- すべての細胞は培地に再懸濁していることを確認するために数回上下にピペッティングし。
- 滅菌15ミリリットルキャップポリプロピレンチューブに細胞溶液を移す。
- 5分間、400 rcfで遠心する。
- 細胞ペレットを崩さないように確実に....
アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。
ディスカッション
OIは、蛍光の検出に基づいて、比較的新しいイメージング技術です。 OIは、放射性トレーサーベースのイメージング技術と同じくらい敏感ですが、任意の照射への暴露に関連付けられていない。 OIは、それによって標的部位への細胞移動への洞察を提供する、非侵襲的かつ反復的に追跡する細胞の効果的な手段を提供します。テクニックの一つの主要な制限は、in vivoでの蛍光プローブの限られた組織の浸透です。このように、皮膚の表面から約5-10 cmより多くの深部組織中のトレーサの集積は、検出されない場合があります。現在の臨床応用はこのような、内視鏡心血管および網膜イメージング（Funovicsら、2003）などの表面的なテクニックに限定されているが、研究のこのドメインは、生体内細胞追跡にによって提供される広大な可能性の認識を通して拡大していきます。
....アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。
謝辞
このプロジェクトは、再生医療のためのカリフォルニア工科大学からレオンJ.タールのSEEDの助成金によってサポートされていました。トビアスヘニングは、ドイツ研究協会（DFG、HE 4578/1-2）から奨学金研究によって資金を供給された。我々は感謝してヒト胚性幹細胞の培養上彼のアドバイスをファニートのMenesesを確認応答したい。
....アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。
材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント | |
|---|---|---|---|---|
| インドシアニングリーン (IR-125) | 試薬 | Fisher Scientific | AC41254-1000 | |
| DMSO | 試薬 | Sigma-Aldrich | D-2650 | |
| D-MEM 高グルコース | 試薬 | Sigma-Aldrich | D5648 | |
| ゼラチン | 試薬 | Sigma-Aldrich | G1890 | PBSで最終濃度0.1%に希釈 |
| PBS (Mg/Ca不含) | 試薬 | GIBCO, by Life Technologies | 14190-144 | |
| Trypsin-EDTA 0.05% | 試薬 | Invitrogen | 25300-120 | |
| Trypsin-EDTA 0.25% | 試薬 | Invitrogen | 25200-114 | |
| FCS (特性解析済み) | 試薬 | Hyclone | SH30071.03 | |
| セルストレーナー (40 μm ナイロン) | 試薬 | BD Biosciences | 352340 | |
| DiD | 試薬 | Molecular Probes, Life Technologies | V-22887 | |
| Knockout DMEM | 試薬 | GIBCO, by Life Technologies | 10829018 | |
| Knockout Serum Replacer | 試薬 | GIBCO, by Life Technologies | 10828028 | |
| β-メルカプト–エタノール | 試薬 | Sigma-Aldrich | 7522 | |
| 非必須アミノ酸 | 試薬 | GIBCO, by Life Technologies | 11140050 | |
| FGF-2 | 試薬 | R&D Systems | 233-FB-025 | |
| グルタミン 200mM | 試薬 | GIBCO, by Life Technologies | 25030081 | |
| ペニシリン/ストレプトマイシン | 試薬 | GIBCO, by Life Technologies | 15140-122 | |
| プロタミン硫酸塩 | 試薬 | American Pharmaceutical Partners |
参考文献
- Daldrup-Link, H. E., Rudelius, M., Metz, S., Piontek, G., Settles, M., Pichler, B., Heinzmann, U., Weinmann, H. J., Schlegel, J., Link, T. M., Rummeny, E. J., Oostendorp, R. A. J. Stem cell tracking with Gadophrin-2 -- a bifunctional contrast agent for MR imaging, optical imaging and fluorescence microscopy. Eur J Nucl Med Mol Imaging. 31, 1312-1321 (2004).
- Simon, G. H., Daldrup-Link, H. ....
アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。
再版と許可
