गिरता हैंगिंग Shrinky dink: एक सरल फॉर्म और संस्कृति embryoid निकायों
Summary
हम एक सरल और तेजी से विधि microfabricated कुओं में कक्षों की पूर्व निर्धारित संख्या लोड और उन्हें embryoid शरीर के विकास के लिए बनाए रखने दिखा.
Abstract
Embryoid निकायों (EB) भ्रूण स्टेम कोशिकाओं का समुच्चय हैं. इन समुच्चय बनाने का सबसे आम तरीका फांसी ड्रॉप विधि, अच्छी तरह प्लेटों में कक्षों की एक मनमाना संख्या pipetting के एक श्रमसाध्य दृष्टिकोण है. एक दूसरे के करीब निकटता में मजबूर स्टेम कोशिकाओं के बीच बातचीत ईबीएस की पीढ़ी को बढ़ावा देता है. क्योंकि कुओं की प्रत्येक में मीडिया के लिए मैन्युअल रूप से हर दिन विमर्श किया जा, इस दृष्टिकोण मैन्युअल गहन है.
इसके अलावा, क्योंकि सेल सेल, सेल घुलनशील कारक बातचीत, पीएच, और ऑक्सीजन की उपलब्धता सहित पर्यावरण मापदंडों EB आकार का कार्य किया जा सकता है, सेल पारंपरिक फांसी बूंदों से प्राप्त आबादी नाटकीय रूप से भी भिन्न जब समान शर्तों के तहत संवर्धित कर सकते हैं. वास्तव में हाल के अध्ययनों से पता चला है कि कुल कोशिकाओं के गठन की प्रारंभिक संख्या स्टेम सेल भेदभाव पर महत्वपूर्ण प्रभाव हो सकता है. हम एक सरल, तेजी से और स्केलेबल संस्कृति microfabricated कुओं में कक्षों की पूर्व निर्धारित संख्या लोड और उन्हें embryoid शरीर के विकास के लिए बनाए रखने के विधि विकसित किया है. अंत में, इन कोशिकाओं को आगे के विश्लेषण और प्रयोग के लिए आसानी से सुलभ हैं. यह विधि किसी भी प्रयोगशाला करने के लिए उत्तरदायी है और कोई समर्पित उपकरणों की आवश्यकता है. हम embryoid शरीर एक लाल फ्लोरोसेंट माउस सेल लाइन (129S6B6 F1) का उपयोग कर बनाने के द्वारा इस विधि का प्रदर्शन.
Protocol
Discussion
हम एक सरल, तेजी से और स्केलेबल संस्कृति microfabricated कुओं (Shrinky – Dinks से molded) में कक्षों की पूर्व निर्धारित संख्या लोड और उन्हें embryoid शरीर के विकास के लिए बनाए रखने के विधि विकसित किया है. अंत में, इन कोशिकाओं को आगे के विश्लेष?…
Acknowledgements
हम इस काम के समर्थन के लिए सीआईआरएम धन्यवाद देना चाहूंगा. सेल लाइन उदारता माउंट सिनाई अस्पताल, टोरंटो, ओंटारियो में डा. Andras नेगी से दान था.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Shrink-Dink Film | Material | K&B Innovations | D300-10A | |
| PDMS | Material | Dow Corning | Sylgard 184 | |
| Acetone | Reagent | Fisher Scientific | A16P-4 | |
| Ethanol | Reagent | Fisher Scientific | A405P-4 | |
| PBS | Reagent | Sigma | P4417 | |
| BMP-4 | Reagent | R and D systems | 314-BP-010 | |
| Knock-Out DMEM (KO DMEM) | Reagent | Invitrogen | 10829 | |
| KnockOut Sirum Replacement (KSR) | Reagent | Invitrogen | 10828 | |
| Penn-Strep | Reagent | Invitrogen | 15070-063 | |
| L-glutamine | Reagent | Invitrogen | 25030-081 | |
| Non-essential Amino Acids (NEAA) | Reagent | Invitrogen | 11140 | |
| D-mercaptoethanol (BME) | Reagent | Calbiochem | 444203 | |
| Leukemia Inhibitory Factor (LIF) {ESGRO 106 units} | Reagent | Chemicon | ESG1106 | |
| Printer | Tool | HP | Laser Jet 2420d | |
| Oven | Tool | Yamato Scientific | DP-22 | |
| For the mESC media(McCloskey lab protocol): (for total media prepared: 50ml; 100ml) KO DMEM: 40.8ml; 81.6ml 15% KSR: 7.5ml; 15ml 1x Penn-Strep: .5ml; 1ml 2mM L-glutamine: .5ml; 1ml NEAA : .5ml; 1ml LIF: 100ul; 200ul BMP-4 (10ng/ml): 50ul; 100ul Diluted BME: 50ul; 100ul (Add 35ul of sterile filtered BME to 5ml of PBS and syringe filter sterilize. Discard after 2 weeks. Final concentration in the solution is .1mM) | ||||
References
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- Doetschman, T. C., Eistetter, H., Katz, M., Schmidt, W., Kemler, R. The in vitro development of blastocyst-derived embryonic stem cell lines: Formation of visceral yolk sac, blood islands and myocardium. Journal of Embryology and Experimental Morphology. 87, 27-45 (1985).
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