Neutrofielen behoren tot de eerste cellen aan te komen op de site van inflammatoire immuunrespons, en hun functies en mechanismen zijn uitgebreid bestudeerd in vitro. Demonstreren we een standaard dichtheidsgradiënt scheidingsmethode voor de menselijke neutrofielen isoleren van volbloed met in de handel verkrijgbaar scheiding media.
Abstract
Neutrofiele granulocyten polymorfonucleaire (PMN) zijn de meest voorkomende leukocyten bij mensen en bij de eerste cellen aan te komen op de site van inflammatoire immuunrespons. Vanwege hun belangrijke rol in ontstekingen, zijn neutrofielen functies zoals motoriek, cytokine productie, fagocytose, en de tumorcel te bestrijden uitgebreid bestudeerd. Te bepalen wat de specifieke functies van neutrofielen, een schone, snelle en betrouwbare methode om ze te scheiden van andere bloedcellen is wenselijk voor in-vitro-studies, vooral omdat neutrofielen zijn van korte duur en moet worden gebruikt binnen 2-4 uur van de collectie. Hier tonen we een standaard dichtheidsgradiënt scheidingsmethode voor de menselijke neutrofielen isoleren van volbloed met in de handel verkrijgbaar scheiding media dat is een mengsel van natrium-metrizoate en Dextran 500. De procedure bestaat uit lagen volbloed op de dichtheidsgradiënt medium, centrifugeren, scheiding van neutrofielen laag, en lysis van erytrocyten rest. Cellen worden vervolgens gewassen, geteld, en opnieuw gesuspendeerd in buffer tot de gewenste concentratie. Bij het correct wordt uitgevoerd, is deze methode is aangetoond dat monsters van> 95% neutrofielen met> 95% levensvatbaarheid opbrengst.
Protocol
Neutrofielen Isolatie Protocol Breng alle reagentia op kamertemperatuur. Verzamel 5,0 ml van neutrofielen isolatie media in centrifugebuis. Voorzichtig laagje 5,0 ml bloed over de scheiding media. Voer deze stap langzaam en voorzichtig, en met de pipet tip dicht bij de oppervlakte van de media om te voorkomen dat het mengen van het bloed en de media. Centrifugeer op 500 RCF gedurende 35 min bij 20-25 ° C. Het bloed op moet scheiden in 6 verschillende bands: plasma, monocyten, isolatie med…
Discussion
De dichtheid gradiënt scheiding methode wordt gebruikt om de menselijke neutrofielen isoleren van volbloed met een mengsel van natrium-metrizoate en Dextran 500. Deze methode is gebaseerd op de mononucleaire leukocyten scheiding methode Boyum (1968), die was voor neutrofielen scheiding gewijzigd door Ferrante en Thong (1980).
Na het verzamelen van een donor, kan volledig bloed worden antistolling met EDTA, citraat of heparine. Omdat ze van korte duur, moet neutrofielen worden gebruikt binnen 2-4 uur van de collectie. De procedure b…
Acknowledgements
De financiering van NIH R01 HL56621.
Materials
Material Name
Type
Company
Catalogue Number
Comment
Lymphocyte Poly(R)
Reagent
Cedarlane Labs
PolymorphprepTM can be used as an alternative
Hank’s Balanced Salt Solution without Calcium Chloride
Reagent
Invitrogen Gibco
Human Serum Albumin
Reagent
ZLB Bioplasma
Red Cell Lysis Buffer
Reagent
Roche Diagnostics
Centrifuge
Tool
Vortexer
Tool
Pasteur Pipettes and bulb
Tool
PolymorphprepTM
Reagent
Axis-Shield PoC
Alternative reagent to Lymphocyte-Poly (R)
Syringe Filter
Other
Millipore
SLGV033RS
Millex-GV, 0.22 µm, PVDF, 33 mm, gamma-sterilizable
Hank’s Balance Salt Solution with Calcium Chloride