Gemethyleerd DNA Immunoprecipitatie
Summary
Deze video toont het protocol voor gemethyleerd DNA immunoprecipitatie (MeDIP). MeDIP is een twee dagen procedure die selectief gemethyleerd DNA-fragmenten extracten van een genomische DNA-monster met behulp van antilichamen met specificiteit voor 5-methylcytosine (anti-5 mC).
Abstract
De identificatie van DNA-methylatie patronen is een gemeenschappelijke procedure in de studie van de epigenetica, zoals methylatie is bekend dat significante effecten op de genexpressie hebben, en is betrokken bij een normale ontwikkeling en ziekte<sup> 1-4</sup>. Zo is de mogelijkheid om onderscheid te maken tussen gemethyleerd DNA en niet-gemethyleerd DNA is essentieel voor het genereren van methylatie profielen voor dergelijke studies. Gemethyleerd DNA immunoprecipitatie (MeDIP) is een efficiënte techniek voor de extractie van gemethyleerd DNA van een steekproef van belang<sup> 5-7</sup>. Een monster van zo weinig als 200 ng van DNA is voldoende voor het antilichaam, of immunoprecipitatie (IP), reactie. DNA is gesoniceerd in fragmenten, variërend in grootte van 300-1000 bp, en is verdeeld in immunogeprecipiteerd (IP) en de ingang (IN) porties. IP-DNA wordt vervolgens warmte gedenatureerd en vervolgens geïncubeerd met anti-5'mC, waardoor het monoklonale antilichaam om gemethyleerd DNA te binden. Na dit, zijn magnetische korrels met een secundair antilichaam met affiniteit voor het primaire antilichaam toegevoegd en geïncubeerd. Deze kraal-linked antilichamen binden het monoklonale antilichaam dat wordt gebruikt in de eerste stap. DNA gebonden aan het antilichaam complex (gemethyleerd DNA) is gescheiden van de rest van het DNA met behulp van een magneet om de complexen te trekken uit de oplossing. Enkele wasbeurten met behulp van IP-buffer worden dan uitgevoerd om de ongebonden, niet-gemethyleerd DNA te verwijderen. De gemethyleerde DNA / antilichaam complexen worden dan verteerd met proteïnase K aan de antilichamen waardoor alleen de gemethyleerd DNA intact te verteren. De verrijkte DNA wordt gezuiverd door fenol: chloroform extractie aan het eiwit materiaal te verwijderen en vervolgens geprecipiteerd en geresuspendeerd in water voor later gebruik. PCR-technieken kunnen worden gebruikt om de efficiëntie van de MeDIP te valideren door het analyseren van de amplificatieproducten van IP en in DNA voor de regio's waarvan bekend is dat het gebrek en waarvan bekend is dat gemethyleerde sequenties bevatten. Het gezuiverde gemethyleerd DNA kan vervolgens worden gebruikt voor de locus-specifieke (PCR) of genoom-brede (microarray en sequencing) methylering studies, en is vooral handig wanneer toegepast in combinatie met andere research tools zoals gen expressie profilering en array comparatieve genoom hybridisatie ( CGH)<sup> 8</sup>. Nader onderzoek naar DNA methylatie zal leiden tot de ontdekking van nieuwe epigenetische doelstellingen, die op hun beurt, kunnen nuttig zijn bij de ontwikkeling van nieuwe therapeutische of prognostische onderzoek tools voor ziekten zoals kanker die gekenmerkt worden door afwijkend gemethyleerd DNA<sup> 2, 4, 9-11</sup>.
Protocol
Discussion
Er is een groeiend besef van de belangrijke rol van DNA-methylatie speelt bij de ziekte, zijn daarom de ontwikkeling van assays om deze wijziging te meten steeds belangrijker 3, 12, 13. De MeDIP techniek is een hulpmiddel vatbaar voor het screenen van zowel het hele genoom en locus-specifieke niveau 6, 7. Deze techniek zorgt voor een snelle weergave van DNA-methylatie niveaus met behulp van beperkte hoeveelheden van het starten van DNA en maakt een eenvoudige vergelijkingen tussen verschillende bro…
Acknowledgements
Wij willen de leden van de Brown en Lam laboratoria bedanken voor hun deelname aan bekritiseren deze video en artikel. Dit werk werd ondersteund met middelen uit het Canadese Institutes for Health Research en de Michael Smith Foundation for Health Research.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Biorupter sonicator | Tool | Diagenode | UCD-200 TM | |
| 1.7ml SafeSeal Microcentrifuge Tubes | Other | Sorenson BioScience | 11510 | |
| ND 3300 Spectrophotometer | Tool | NanoDrop | ||
| Primary Antibody: Anti-5′-methylcytosine mouse mAb | Reagent | CalBiochem | 162 33 D3 | |
| Secondary Antibody: Dynabeads M-280 Sheep anti-mouse IgG | Reagent | Invitrogen | 112-01D | |
| Magnetic Tube Rack | Tool | Invitrogen | CS15000 | |
| Mini LabRoller | Tool | Labnet International | H5500 | |
| IP Buffer | 10 mM NaPO4 pH 7.0, 140 mM NaCl, 0.05% Triton X-100. Stored at room temperature | |||
| Digestion Buffer | 10 mM Tris pH8.0, 100 mM EDTA, 0.5% SDS, 50 mM NaCl |
References
- Beck, S., Rakyan, V. K. The methylome: approaches for global DNA methylation profiling. Trends Genet. 24, 231-237 (2008).
- Lu, Q., et al. Epigenetics, disease, and therapeutic interventions. Ageing research reviews. 5, 449-467 (2006).
- Zilberman, D., Henikoff, S. Genome-wide analysis of DNA methylation patterns. Development. 134, 3959-3965 (2007).
- Feinberg, A. P., Tycko, B. The history of cancer epigenetics. Nature reviews. 4, 143-153 (2004).
- Weber, M., et al. Distribution, silencing potential and evolutionary impact of promoter DNA methylation in the human genome. Nat Genet. 39, 457-466 (2007).
- Weber, M., et al. Chromosome-wide and promoter-specific analyses identify sites of differential DNA methylation in normal and transformed human cells. Nat Genet. 37, 853-862 (2005).
- Wilson, I. M., et al. Epigenomics: mapping the methylome. Cell Cycle. 5, 155-158 (2006).
- Gazin, C., Wajapeyee, N., Gobeil, S., Virbasius, C. M., Green, M. R. An elaborate pathway required for Ras-mediated epigenetic silencing. Nature. 449, 1073-1077 (2007).
- Karpinski, P., Sasiadek, M. M., Blin, N. Aberrant epigenetic patterns in the etiology of gastrointestinal cancers. Journal of applied. 49, 1-10 (2008).
- Maekawa, M., Watanabe, Y. Epigenetics: relations to disease and laboratory findings. Current medicinal chemistry. 14, 2642-2653 (2007).
- Vucic, E. A., Brown, C. J., Lam, W. L. Epigenetics of cancer progression. Pharmacogenomics. 9, 215-234 (2008).
- Egger, G., Liang, G., Aparicio, A., Jones, P. A. Epigenetics in human disease and prospects for epigenetic therapy. Nature. 429, 457-463 (2004).
- Jones, P. A., Baylin, S. B. The fundamental role of epigenetic events in cancer. Nat Rev Genet. 3, 415-428 (2002).
- Fraga, M. F., Esteller, M. DNA methylation: a profile of methods and applications. Biotechniques. 33, 632-649 (2002).
