チックの全マウントの抗体染色のための方法
Summary
このビデオでは、全体のマウント免疫組織化学、抗原の空間的および時間的発現パターンは、若いニワトリ胚における可視化することができる方法を示しています。このメソッドは当初、ジェーンドッドとトムJessellによって導入されました。
Abstract
ニワトリ胚は、初期胚発生の研究に貴重なツールです。その透明性、アクセス性と操作の容易さ、それを脳、神経管や体節の開発に抗体発現を研究するための理想的なツールとなっています。このビデオでは、HRP標識二次抗体を用いたホールマウントの抗体染色で別の手順を示し、まず、胚は卵から解剖し、パラホルムアルデヒドで固定されています。第二に、内因性ペルオキシダーゼの不活化であり、胚は、その後一次抗体にさらされています。数回の洗浄後、胚は、HRPにコンジュゲートした二次抗体とインキュベートされる。ペルオキシダーゼ活性は、ジアミノベンジジン基質との反応を用いて明らかにされる。最後に、胚を固定して、写真とセクショニングのために処理されます。蛍光抗体の使用に比べてこの方法の利点は、胚は、このような断面で抗原部位の調査を可能にする、ワックスのセクショニングのために処理できることです。このメソッドは当初、ジェーンドッドとトムJessellによって導入された<sup> 1</sup>。
Protocol
Discussion
このビデオでは、若いニワトリ胚のホールマウントの抗体染色を行うことで様々なステップを示しています。このプロトコルは、本質的に空間的および時間的ひよこ2,3における新規抗体の特徴だけでなく、侮辱4次胚の奇形を決定するために、既知の抗原マーカーの使用のために使用されます。
Acknowledgements
（J.ドッド、TM JessellとA.川上）によって開発されたモノクローナル抗体は（15.3B9、PAX7）生物科学科、アイオワ大学でNICHDと維持の後援の下に開発された発達研究ハイブリドーマバンクから入手した、アイオワ州。 DPは、薬物乱用の国民の協会からルースキルシュシュタイン賞1F32 DA021977 – 01A1の受信者です。この作品は、RHFへマーガレットM. Alkek財団によってサポートされていました。
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Eggs | Charles River Laboratories | Premium Fertile | Fertilized, HH4 (16 hr) | |
| Stereomicroscope | Microscope | Leica Microsystems | MZ9.5 or similar | |
| Marsh Automatic Incubator | Other | Lyon | RX | |
| Curved Forceps (1) | Tool | Electron Microscopy Sciences | 72991-4C | |
| Forceps (2) | Tool | Fine Science Tools | 11002-13 | |
| Fine scissors | Tool | Fine Science Tools | 14161-10 | |
| Plastic dishes | Tool | Falcon | 353001 | |
| Rubber Bulb | Tool | Electron Microscopy Sciences | 70980 | |
| Pasteur Capillary Pipette | Tool | Electron Microscopy Sciences | 70950-12 | round edge under flame |
| Microdissecting knife | Tool | Fine Science Tools | 10056-12 | Use to cut embryo from surrounding membranes following fixation |
| Sylgard 184 Silicon Elastomer Curing Agent and Base | Reagent | Dow Corning | 0001986475 | Mix 1 part Curing Agent, 9 parts Base; set O/N at 37C |
| 16% PFA | Reagent | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| 30% H2O2 | Reagent | Sigma | H1009 | |
| BSA | Reagent | Sigma | A3803 | |
| NGS | Reagent | Jackson Immuno | 005-000-121 | |
| Primary Antibodies | Reagent | Developmental studies Hybridoma Bank | 4G11, 15.3B9, PAX7 | For these antibodies, investgators used mouse donnors |
| Peroxidase conjugated-Goat Anti-Mouse IgG (H+L) | Reagent | Jackson Immuno | 115-035-003 | |
| 3,3’-diaminobenzidine tetrahydrochloride | Reagent | Pierce | 34001 | Store at -20; Allow bottle to warm to RT before use. |
| Cedar wood oil | Reagent | Sigma | W522503 | |
| Fast green FCF | Reagent | Sigma | F7252 | |
| Minuten pins 0.2mm diam | Fine Science Tools | 26002-20 |
References
- Yamada, T., Placzek, M., Tanaka, H., Dodd, J., Jessell, T. M. Control of cell pattern in the developing nervous system: Polarizing activity of the floor plate and notochord. Cell. 64, 635-647 (1991).
- Streit, A., Stern, C. D., Thery, C., Ireland, G. W., Aparicio, S., Sharpe, M. J., Gherardi, E. A role for HGF/SF in neural induction and its expression in Hensen’s node during gastrulation. Development. 121, 813-824 (1995).
- Basch, M., Bronner-Fraser, M., Garcia-Castro, M. Specification of neural crest occurs during gastrulation and requires Pax7. Nature. 441, 218-222 (2006).
- Psychoyos, D., Stern, C. D. Restoration of the organizer after radical ablation of Hensen’s node and the anterior primitive streak in the chick embryo. Development. 122, 3263-3273 (1996).
