Wysokoprzepustowa metoda globalnego badania morfologii organelli u S. cerevisiae
March 2nd, 2009
Białka fuzyjne GFP są powszechnie używane do wizualizacji organelli za pomocą mikroskopii konfokalnej. Jednak badania przesiewowe w kierunku mutacji, które wpływają na morfologię organelli, na ogół wymagają indywidualnej mutagenezy i są czasochłonne. W tym miejscu demonstrujemy metodę jednoczesnego włączania markerów organelli-GFP do prawie 5000 nieistotnych genów drożdży.
Ta procedura rozpoczyna się od przygotowania macierzy CP jeden GFP, najpierw hodując linię komórek, a następnie przypinając macierz na świeżej płytce. W tym samym czasie przygotuj nowy egzemplarz DMA. Następnie łączymy jedną macierz GFP ACP z DMA i wybieramy diploidy, które są następnie zarodnikowane na pożywce zarodnikowej.
Pięć dni później potomstwo miotyczne kiełkuje na pożywce LRK, na której będą rosły tylko haplosy MAT A. Poprzez dwie dodatkowe rundy selekcji odzyskujemy komórki haplo przenoszące zarówno ACP, jeden GFP, jak i gen znokautowany na puszce mycyny. Na koniec możemy wybrać poszczególne szczepy bezpośrednio z płytki i obserwować morfologię mitochondriów za pomocą mikroskopii konfokalnej.
Cześć, jestem Chap T z Laboratorium Prawniczego z Wydziału Biologii Komórki i Rozwoju w Instytucie Nauk Przyrodniczych Uniwersytetu Kolumbii Brytyjskiej. Cześć, nazywam się Jesse Chao, również pracuję w Loan Lab. Dzisiaj pokażemy Państwu wysokoprzepustową metodę wprowadzania markerów lub GFP w różnych zmutowanych tłach drożdży za pomocą systemu robotycznego.
Stosujemy tę procedurę w naszym laboratorium do badania morfologii organelli, takich jak D, retikulum endoplazmatyczne i mitochondria. Więc zacznijmy. Do tego protokołu używamy dwóch różnych szczepów drożdży.
CP jeden GFP jest szczepem z końcowym znakowaniem GFP C ACP jeden, który jest generowany przez rekombinację homologiczną za pośrednictwem A PCR przy użyciu plazmidu PKT 1 28. Tło szczepu to BY 7 0 4 3. Używamy również szczepu DMA lub macierzy mutantów delecyjnych, która jest macierzą około 5 000 mutantów delecyjnych genów nieistotnych.
Wszystkie te nieistotne geny zostały znokautowane na G 4 18. Tło odkształcenia tablicy to BY 47 41. Aby rozpocząć hodowlę Alana z ACP, należy wylać pięć mililitrów na noc kultury ACP One GFP na syczącą płytkę.
Pozostawić płytkę do wystarczającego wyschnięcia przez płomień lub w biologicznym dygestorium. Po wyschnięciu inkubuj płytkę w temperaturze 30 stopni Celsjusza przez noc. Po inkubacji użyj robota, aby ułożyć szczep A CP one GFP w 1 536 koloniach na płytkę.
W tym samym czasie przygotuj nowy egzemplarz DMA poprzez przypięcie repliki do YPDG czterech 18 tabliczek. Następnie inkubuj płytki w temperaturze 30 stopni Celsjusza przez noc po wzroście szczepów. Wykonano szczep A CP jeden GFP z DMA poprzez replikę przypinania i nakładania kolonii na płytki YPD, inkubacji płytek w temperaturze 30 stopni Celsjusza przez noc.
Po inkubacji płytki repliki, kolonie pod SD syczą G cztery 18 płytek w celu wybrania rozmieszczonych komórek, inkubują płytki w temperaturze 30 stopni Celsjusza przez noc. Aby rozpocząć zarodnikowanie i kiełkowanie, najpierw replikuj płytkę, diploidy umieszcza się na czterech 18 płytkach YPDG, aby zwiększyć wydajność zarodnikowania w następnym kroku. Po inkubacji w temperaturze 30 stopni Celsjusza przez jeden dzień repliki płytki, diploidy trafiają na ulepszone podłoże zarodnikowe, które zawiera obniżony poziom źródeł węgla i azotu, aby indukować tworzenie się zarodników miotycznych.
Następnie inkubuj płytki w temperaturze 25 stopni Celsjusza przez co najmniej pięć dni. Po inkubacji wykiełkować matę, miotyczne potomstwo przez replikę plalokującą kolonie na pożywce LRK. Pożywka ta indukuje kiełkowanie komórek tabloidowych z zarodników, inkubuje płytki w temperaturze 30 stopni Celsjusza przez dwa dni, aby wybrać komórki zawierające zarówno allel GFP, jak i pojedynczy zmutowany allel.
Komórki Matt A są replikowane pod pożywką Lôde G cztery 18, która wybiera komórki haplo przenoszące delecję genu, inkubuje te płytki w temperaturze 30 stopni Celsjusza przez noc. Następnie płyta repliki, mata, miotyczne potomstwo na czterech pożywkach L-H-R-K-G czterech 18 pożywek do selekcji do wzrostu pojedynczych mutantów. Jest to również siedlisko ACP jeden GFP inkubowany przez noc w temperaturze 30 stopni Celsjusza.
Talerze można następnie przechowywać w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez okres do trzech miesięcy. Aby zwizualizować pożądane mutanty wykazujące ekspresję CP jednego GFP bezpośrednio z płytki, zacznij od wybrania pożądanych kolonii z płytek. Hoduj komórki w temperaturze 30 stopni Celsjusza i syczące pożywki YPD lub SD do wczesnej fazy logarytmicznej.
Na koniec uwidocznij mutanta za pomocą mikroskopii konfokalnej z zestawem filtrów GFP na tym obrazie konfokalnym, mutant i typ dziki z jednym markerem GFP ACP zostały uwidocznione za pomocą mikroskopii konfokalnej w celu zbadania morfologii mitochondriów. Ten konkretny mutant wykazuje zaburzony fenotyp mitochondrialny i dlatego jest dobrym kandydatem do dalszych badań. Musieliśmy pokazać ci, jak skutecznie włączyć marker multiklonalny, CP jeden GFP do macierzy mutantów delecyjnych za pomocą systemu robotycznego.
Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby podłoże było świeże i pozostawiło miejsce na wystarczająco dużo czasu na wyschnięcie. Jeśli jest zbyt wilgotna, kondensacja będzie się gromadzić, zwiększając ryzyko zanieczyszczenia. Należy również dokładnie sprawdzić, czy wszystkie nośniki wyboru są wykonane poprawnie, ponieważ mają one kluczowe znaczenie dla tego protokołu.
Ta procedura może być również stosowana w przypadku innych rodzajów markerów. Na przykład, aby zobrazować er, rutynowo używamy markera air 11 i GSP. Więc to wszystko.
Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w eksperymentach.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Przegląd
To badanie przedstawia metodę włączania markerów organelli-GFP do prawie 5000 niezbędnych genów w drożdżach, upraszczając proces wizualizacji morfologii organelli. Stosując tę metodę, naukowcy mogą skutecznie przesiewać mutacje wpływające na strukturę organelli.
Kluczowe komponenty badania
Obszar nauki
- Neuronauki
- Biologia komórki
- Genetyka
Tło
- Białka fuzyjne GFP są kluczowymi narzędziami do wizualizacji struktur komórkowych.
- Tradycyjne metody przesiewania mutacji są pracochłonne.
- Drożdże służą jako organizm modelowy w badaniach genetycznych.
- Mikroskopia konfokalna umożliwia szczegółowe obrazowanie organelli.
Cel badania
- Opracowanie metody jednoczesnego włączania markerów organelli.
- Ułatwienie przesiewania mutacji wpływających na morfologię organelli.
- Zwiększenie efektywności badań genetycznych na drożdżach.
Stosowane metody
- Przygotowanie tablicy CP one GFP z hodowanych komórek.
- Krzyżowanie tablicy GFP z DMA w celu selekcji diploidów.
- Sporulacja diploidów na określonych pożywkach.
- Obserwacja morfologii mitochondriów za pomocą mikroskopi konfokalnej.
Główne wyniki
- Sukcesywne włączenie markerów organelli-GFP do genów drożdży.
- Efektywne odzyskiwanie komórek haploidalnych z pożądanymi modyfikacjami genetycznymi.
- Wizualizacja morfologii organelli za pomocą mikroskopi konfokalnej.
- Uproszczony proces przesiewania mutacji genetycznych.
Wnioski
- Metoda znacznie zmniejsza czas potrzebny na przesiewanie genetyczne.
- Daje solidne ramy do badania funkcji organelli.
- To podejście może być zastosowane do różnych badań genetycznych na drożdżach.
