L'imagerie in vivo de Deep couches corticales utilisant un microprisme

Les techniques de microscopie à fluorescence ont une capacité limitée à imager les structures profondes des tissus, en particulier dans les matériaux à diffusion de lumière élevée tels que le tissu cérébral. Même dans le cas de la microscopie à deux photons, il peut être très difficile de produire des images in vivo de haute qualité de structures neuronales situées à plus de 500 microns de la surface néocorticale. Ici, la ligne verte indique une profondeur de 500 microns.

En général, les couches néocorticales quatre, cinq et six sont à plus de 500 microns de la surface. Nous montrerons comment un micro-prisme de verre d’un millimètre inséré dans le néocortex peut relayer la lumière dans et hors des couches corticales superficielles et profondes. En utilisant cette technique chez une souris, il est possible d’avoir un champ de vision d’un millimètre et de visualiser les six couches corticales simultanément dans une perspective d’imagerie, que l’on ne trouve généralement que dans les tissus cérébraux coupés.

Les microprismes offrent un large champ de vision capable de visualiser les corps cellulaires paramétalliques de la couche cinq avec leurs longues dendrites apicales et le réseau complexe de vaisseaux sanguins dans le néocortex, tout en maintenant des résolutions spatiales capables de résoudre les épines dendritiques et le flux de globules rouges à travers les microcapillaires. Je m’appelle Thomas et je suis étudiant diplômé dans le laboratoire du professeur Michael Levine au département de génie biomédical de l’Université Yale. Le protocole dont nous parlerons dans cette vidéo portera sur la façon d’utiliser des micro-prismes en verre à angle droit d’un millimètre pour générer des images de fluorescence de structures d’un millimètre de profondeur dans un néocortex de souris.

Les micro-prismes que nous utilisons sont des prismes à angle droit d’un millimètre fabriqués à partir de verre BK sept achetés à la société Opto Sigma. Les micro-prismes sont manipulés à l’aide de pinces dans la mesure du possible. L’hypoténuse du micro prisme est recouverte d’argent amélioré pour fournir une réflectivité supérieure à 97 % de 400 à 2000 nanomètres.

Cela fournit une réflexion interne à la fois de la lumière d’excitation laser et de la fluorescence admise. Nous utilisons un microscope à deux photons construit sur mesure, capable d’imager de petits animaux. L’animal attaché à un dispositif stéréotaxique est placé sur une platine motorisée à trois axes.

Le microscope est connecté à un PC Windows exécutant une image de numérisation. Le logiciel scan image est un logiciel d’acquisition d’images écrit dans MATLAB par Polo Gudo, et al. Pour l’imagerie à microprisme, nous collectons des images à une résolution de 10 24 par 10 24 ou cinq 12 x cinq 12 pixels.

De plus, nous scannons généralement à deux millisecondes par ligne ou à quatre millisecondes par ligne. Un aspect important de ce protocole est le type d’objectifs de microscope utilisés en conjonction avec les microprismes. Deux types d’objectifs sont utilisés dans les expériences.

L’objectif de gauche est un objectif aérien à faible ouverture numérique pour l’imagerie à large champ de vision, dans ce cas, un objectif Olympus à quatre x 0,28 NA. L’objectif de droite est un objectif pneumatique de 40 x 0,60 à haute NA avec un collier de correction en verre capable de minimiser les aberrations sphériques induites par zéro à deux millimètres de verre. Afin de préparer la souris à la chirurgie et à l’insertion du microprisme, la première étape consiste à anesthésier correctement l’animal à un niveau adapté aux interventions chirurgicales.

Tout d’abord, le poids de l’animal est enregistré en fonction de la posologie établie. Un volume approprié d’un cocktail de kétamine et de xylazine est aspiré dans une seringue. Les médicaments anesthésiques sont administrés par injection IP à l’aide d’une aiguille de calibre 28.

Une fois que la souris est à un plan d’anesthésie adapté aux interventions chirurgicales, la majorité des poils de la tête de l’animal sont rasés à l’aide d’un tremblement avec une lame numéro 40. Ensuite, du nare est appliqué sur les cheveux restants sur la tête pour aider à créer une surface exempte de poils qui pourraient gêner le microprisme. Pendant l’imagerie, après cinq minutes, l’AN est nettoyé À l’aide d’un coton-tige, l’animal anesthésié est correctement placé dans un dispositif stéréotaxique de souris.

Pendant les interventions chirurgicales et les séances d’imagerie, l’animal est maintenu sur un coussin chauffant rempli d’eau réglé à 36 degrés Celsius. Une fois la tête de l’animal correctement fixée en place, une incision nette est pratiquée le long de la ligne médiale du crâne. Pour séparer la peau, une petite quantité de peroxyde d’hydrogène à 3 % est placée sur un coton-tige et appliquée sur le crâne pour éliminer les membranes entre le crâne et la peau.

Le peroxyde d’hydrogène contribue également à révéler que la BMA est un jalon majeur dans la connaissance de l’endroit où effectuer la craniotomie et insérer le microprisme. Avant le début de la craniotomie, les barres d’oreille et la barre d’occlusion sont correctement ajustées pour incliner le crâne exposé de sorte qu’il soit essentiellement au niveau de la table. Cela fournit une meilleure plate-forme pour la craniotomie.

Une petite fraise dentaire est reliée à un outil Dremel pour les craniotomies. Nous réglons la vitesse à environ 7 000 à 10 000 tr/min. La fraise dentaire est effleurée le long du crâne jusqu’à ce qu’une rainure carrée s’établisse dans l’os.

Les côtés du carré mesurent environ deux à trois millimètres de long et sont centrés. 1,5 millimètre de dorlotement et un rema latéral d’un millimètre continuent d’amincir l’os jusqu’à ce qu’une petite ouverture soit pratiquée à travers le crâne. Une paire de pinces peut soulever le lambeau osseux.

La dure-mère doit être retirée avant que le microprisme puisse être inséré dans le cortex. Le meilleur moyen de contrôler le saignement est de laisser le sang coaguler à la surface pendant plusieurs minutes. Ensuite, le sang coagulé est éliminé à l’aide d’une éponge chirurgicale pour aider à l’alignement du prisme avec le cortex.

La face verticale du micro-prisme est alignée parallèlement aux poignées de la pince. Avec le prisme correctement tenu, l’ensemble du micro-prisme est inséré jusqu’à ce que le haut du prisme affleure la surface néocorticale. Ici, nous pouvons voir le prisme reposant dans le néocortex.

Lorsqu’il est inséré correctement, le micro-prisme doit rester dans la bonne position. Tout saignement qui en résulte est minime et peut être absorbé avec une petite éponge chirurgicale. Une fois le prisme en place, l’animal est prêt pour l’imagerie avec l’animal.

Sous un objectif à faible grossissement, on peut voir la trame laser balayer au-dessus du microprisme à la surface du cerveau. Voici quelques exemples représentatifs d’images prises sur des souris transgéniques exprimant une protéine fluorescente jaune. Dans les neurones corticaux de la cinquième couche à l’aide de micro-prismes, on peut voir une collection de grands corps cellulaires paramétalliques dans la couche cinq, à près d’un millimètre sous la surface corticale.

On voit également les dendrites apicales qui s’étendent à travers toutes les couches superficielles avant de diverger en Tufts à l’aide d’un objectif à haute ouverture numérique avec le collier de correction en verre, il est possible de résoudre les épines dendritiques dans ce cas. Sur les dendrites apicales des neurones paramétalliques de la couche cinq, les épines dendritiques sont des structures submicroniques et plusieurs sont identifiées sur l’image à l’aide de pointes de flèches jaunes. On peut également marquer les vaisseaux sanguins corticaux avec un colorant fluorescent, tel que la fluorescéine dextran, en utilisant des techniques d’injection établies dans la veine de la queue.

En utilisant cette technique, on peut voir les vaisseaux de plus gros calibre des couches profondes s’étendre vers le PIA et se ramifier pour former le réseau de micro-capillaires. Ce réseau délicat de microcapillaires dans le néocortex est mieux apprécié à l’aide d’un objectif à haute ouverture numérique. De plus, il est possible de mesurer la vitesse et le flux des globules rouges à partir des capillaires néocorticaux profonds par balayage linéaire.

La ligne rouge indique le motif de balayage linéaire sur l’image capillaire à travers le microprisme. Étant donné que les globules rouges n’absorbent pas le colorant fluorescent, ils apparaîtront sous forme de traînées sombres. L’image du bas est le résultat d’un balayage linéaire avec une dimension spatiale dans l’un des AE et une dimension temporelle dans l’autre.

Les EI de celui-ci peuvent calculer le flux et la vitesse des globules rouges à travers le capillaire. Après l’utilisation d’un microprisme chez un animal, il peut être réutilisé plusieurs fois. Cependant, il doit être correctement nettoyé pour éliminer toute matière biologique restante.

Cela peut être accompli en trempant le prisme dans un petit volume d’acide chlorhydrique, suivi d’un trempage dans du méthanol. Le micro-prisme propre peut ensuite être enveloppé dans du papier pour lentille jusqu’à l’utilisation de la fonctionnalité. Ceci conclut notre protocole sur l’utilisation de microprismes pour l’imagerie corticale in vivo chez la souris.

L’utilisation de microprismes dans une expérience d’imagerie est relativement simple et offre de nombreux avantages lorsqu’il s’agit d’études in vivo sur le néocortex. Nous espérons que vous avez trouvé que c’est une technique intéressante et que vous pourrez l’utiliser dans votre laboratoire à l’avenir. Merci d’avoir regardé et bonne chance.