Замораживание и размораживание человеческих эмбриональных стволовых клеток

Здравствуйте, меня зовут Лия Кент из STEM Gen. Сегодня мы покажем вам, как размораживать и замораживать человеческие эмбриональные стволовые клетки. Итак, приступим.

Чтобы разморозить эмбриональные стволовые клетки человека, криопробирку извлекают из жидкого азота и быстро размораживают. На водяной бане при температуре 37 градусов Цельсия клеточную суспензию переносят из криопрошина в коническую пробирку, разбавленную средой для культивирования клеток человека и центрифугируют. Для получения мелкой клеточной гранулы надосадочную жидкость затем удаляют, и клеточную гранулу ресуспендируют со свежей средой для культуры клеток человека в пробирке перед нанесением покрытия на одну лунку из шести лунок на планшете для культивирования клеток, предварительно покрытом облученным слоем питателя метамфетамина.

За день до размораживания человеческих ES-клеток наносят питательный слой облученных мышей, эмбрионов, фибробластов или MES в культуре метамфетамина. Среда в одной лунке с желатиновым покрытием покрыта шестью лунками для культивирования тканей. Инкубируйте тарелку в течение ночи при температуре 37 градусов Цельсия и 5% углекислом газе.

Чтобы обеспечить эффективную и успешную оттепель, обязательно имейте наготове все необходимое оборудование и реагенты. Перед удалением ЭСЛ человека из жидкого азота. С помощью металлических щипцов извлеките криогенный флакон с человеческим E ESL из резервуара для хранения жидкого азота.

Покатайте флакон между руками в перчатках в течение трех-пяти секунд. Чтобы снять иней, запишите информацию на этикетку флакона с помощью металлических щипцов. Погрузите флакон в водяную баню с температурой 37 градусов Цельсия.

Осторожно поворачивайте флакон и наблюдайте за ходом оттаивания часто, но быстро, поднося флакон к свету. Чтобы увидеть размер кристалла льда. Не погружайте крышку флакона в водяную баню, так как это может привести к загрязнению клеток.

Когда останется только небольшой кристалл льда, погрузите флакон в этанол, чтобы стерилизовать его в стерильном шкафу биологической безопасности, переложите содержимое криогенного флакона прямо на дно конической пробирки объемом 15 миллилитров. Медленно добавьте четыре миллилитра культуры клеток ES человека. Средняя к трубке.

Осторожно покачивайте пробирку, постоянно перемешивая ячейки по мере добавления новой среды в пробирку. Центрифугируйте клетки человека в течение пяти минут при давлении 200 G, пока клетки находятся в центрифуге. Достаньте ранее подготовленную тарелку для подачи метамфетамина из инкубатора с температурой 37 градусов Цельсия и пометьте ее соответствующей информацией о ESL человека, такой как клеточная линия, номер прохода и оттепель. Дата.

Отсадите питательную среду MEF и добавьте в лунку один миллилитр PBS. Верните гранулированный человеческий E ESL обратно в шкаф биологической безопасности и осторожно отасуньте надосадочную жидкость. Будьте осторожны, чтобы не аспирировать клеточную гранулу, но удалите как можно больше надосадочной жидкости, так как этот раствор содержит ДМСО из замораживающей среды. Ресус.

Очень осторожно взвесьте гранулу, добавив 2,5 миллилитра питательной среды для человека ESL. С помощью пятимиллилитровой стеклянной пипетки и пипетирования три-четыре раза отсасывайте PBS из питателя MEF. Хорошо и медленно добавьте все 2,5 миллилитра суспензии человеческих ES-клеток в подготовленную лунку шестилуночной пластины.

Поместите пластину в инкубатор с температурой 37 градусов Цельсия и осторожно сдвиньте пластину вперед назад и из стороны в сторону, чтобы равномерно распределить ячейки по всей лунке. Чтобы избежать концентрации колоний в центре. Не закручивайте тарелку по кругу.

Дайте ячейкам прикрепиться при температуре 37 градусов Цельсия и 5% углекислого газа в течение ночи на следующий день после оттепели. Удалите среду с любыми плавающими клетками и добавьте 2,5 миллилитра свежей культуры человеческих ES-клеток. Средний до скважины.

Инкубируйте планшеты при температуре 37 градусов Цельсия и 5% углекислого газа в течение ночи и продолжайте культивировать, пока колонии не будут готовы к прохождению. Протокол замораживания человеческих ЭС-клеток начинается со здоровых колоний ЭС-клеток среднего размера, культивируемых на шестилуночном планшете. После инкубации культуры с четвертым ферментом коллагеназы колонии соскабливают пятимиллилитровой стеклянной пипеткой, собранной в коническую пробирку, и центрифугируют для образования гранулы рыхлых клеток.

После отсасывания надосадочной жидкости клеточную гранулу ресуспендируют. Сначала в среде для культивирования клеток ES человека, а затем разбавляют двумя x криоконсервацией. Терпимая. Клетки равномерно распределяют по одному миллилитру, аликвотам, и замораживают в криогенных флаконах.

Пока клетки находятся в центрифуге, наклейте на криогенные флаконы внутри защитного шкафа номер прохода клеточной линии и дату замораживания. Типичная плотность для замораживания человеческих E-es клеток составляет одну лунку клеток из шестилуночного планшета на криогенный флакон. После центрифугирования человеческого E ESL верните пробирку обратно в шкаф биологической безопасности.

Отсасывайте надосадочную жидкость из трубки. Будьте осторожны, чтобы не потревожить неплотно упакованную ячейку гранулы Resus. Суспензируйте клеточную гранулу с соответствующим количеством культуры ESL человека.

Среда 0,5 миллилитра культуры ЭСЛ человека. Среда на криогенный флакон. Будьте очень осторожны при пипетировании, так как человеческие клетки E es лучше восстанавливаются при замораживании в относительно больших колониях, медленно, осторожно встряхивая пробирку, добавьте к клеткам соответствующее количество двух x Human E es cell freezing medium.

После добавления замораживающей среды перемешайте путем пипетирования раствор чрезвычайно осторожно, один или два раза быстро, но осторожно добавьте по одному миллилитру клеточной суспензии в каждый криогенный файл. Переложите флаконы в контейнер для заморозки изопропанола и поместите в морозильную камеру с температурой минус 80 градусов Цельсия на ночь. На следующий день клетки будут замораживаться со скоростью один градус Цельсия в минуту в контейнере для заморозки изопропанола.

Быстро перенесите замороженные флаконы в резервуар для хранения жидкого азота с помощью металлических щипцов. В первый день после того, как человеческие ЭС-клетки не будут учтены, небольшие колонии могут казаться прозрачными и их может быть трудно разглядеть под микроскопом. С тех пор появилась мысль о том, что человеческие ЭСЛ имеют тенденцию распространяться довольно медленно.

Им может потребоваться несколько дней в культуре, чтобы они превратились в устоявшиеся колонии. Мы только что показали вам, как размораживать и замораживать культуры человеческих эмбриональных стволовых клеток. Вот и все.

Спасибо за просмотр и удачи в ваших экспериментах.