식물 세포 벽의 종합 작곡 분석 (리그노셀룰로오스성 바이오 매스) 부 I : 리그닌

식물 세포벽의 리그닌 함량 및 조성을 결정하는 과정은 건조된 식물 재료에서 시작하며, 이를 다양한 추출 공정에 회부합니다. 결과물은 세포벽으로만 구성되며, 이후 리그닌 함량을 결정하기 위해 분할됩니다. 세포벽 재료는 아세틸 브로마이드(acetyl bromide)를 이용한 가수분해 과정을 거치며, 가용화된 모노머들은 리그닌 조성을 결정하기 위해 UV 분광법으로 정량 분석합니다.

세포벽 물질은 세포 용해(cytolysis)에 의해 가수분해됩니다. 가용화된 리그닌 성분은 이후 휘발성 트리메틸 실릴 유도체로 유도체화되며, 이는 질량 분석법과 결합된 가스 크로마토그래피를 사용하여 분리 및 정량할 수 있습니다. 매트릭스 다당류 조성 및 셀룰로오스 함량의 측정 방법은 "식물 세포벽의 종합적 조성 분석, 제2부 탄수화물"이라는 제목의 다른 영상에서 설명합니다.

안녕하세요, 저는 미시간 주립대학교 Great Lakes Bioenergy Research Center 내 Wall Analytical 시설의 책임자인 Marcus Pauley입니다. 저는 분석 세포벽 시설의 매니저인 Cliff Foster입니다. 식물 바이오매스 시료의 함량과 조성을 결정하는 절차를 보여드리겠습니다.

식물은 태양의 빛 에너지를 바이오매스와 같은 화학 에너지로 전환합니다. 식물 바이오매스는 주로 모든 식물 세포를 둘러싸고 있는 다양한 폴리머의 복합 네트워크인 세포벽으로 구성됩니다. 본 연구에서는 풍부한 재생 가능 자원인 리그닌 Cellose X를 바이오 연료로 전환할 수 있는 가능성을 평가하기 위해 식물 세포벽 물질의 조성을 결정합니다.

오늘은 "식물 세포벽의 종합적 성분 분석, 제2부 탄수화물"이라는 제목의 또 다른 영상에서 폴리페놀 리그닌에 집중해 보겠습니다. 여기서는 다당류 분석을 중심으로 다루겠습니다. 이 절차를 시작하려면, 2 mL 스크류 캡 튜브에 5.5 mm 스테인리스 스틸 볼 3개와 약 60~70 mg의 공기 건조 또는 동결 건조된 식물 시료를 넣으십시오.

분쇄 및 분주 로봇인 eyewall을 사용하여 시료를 미세 분말로 분쇄할 수 있습니다. eyewall이 튜브를 잡고 30초 동안 흔들면, 내부에 포함된 금속 구슬에 의해 시료가 미세 분말로 분쇄됩니다. 그 다음, 분쇄되었으나 뭉쳐 있는 식물 분말을 로봇을 사용하지 않는 대안적인 저처리량 절차로 풀어줍니다. 역추출을 용이하게 하는 방법은 두 번째 부분에서 설명하며, 분쇄된 시료에 1.5 M 70% 수성 에탄올을 첨가하고 충분히 볼텍싱한 후 상온에서 원심분리합니다.

이 처리는 대부분의 단백질과 세포 소기관을 가용화합니다. 상층액을 흡입하고 1:1 부피 비율의 클로로포름-메탄올 용액을 알코올 불용성 펠렛에 추가합니다. 펠렛이 다시 부유될 때까지 충분히 흔든 후 원심분리합니다. 클로로포름-메탄올은 지질과 같은 소수성 화합물을 추출합니다. 원심분리 후 상층액을 흡입하고 500 µL의 아세톤으로 펠렛을 재현탁합니다.

샘플을 건조하려면 35 °C의 공기 흐름으로 용매를 증발시켜 건조하며, 건조된 샘플은 추가 공정 전까지 실온에서 보관할 수 있습니다. 샘플 잔해에서 전분을 제거하기 시작하려면, 펠릿과 1.5 mL의 0.1 M 아세트산나트륨(pH 5)을 현탁시킨 후 튜브 캡을 닫고 가열 블록에서 가열하여 전분을 호화시킵니다. 현탁액을 얼음 위에서 냉각시킨 후 전분 분해 효소 믹스를 추가하고, 튜브 캡을 닫은 뒤 충분히 볼텍싱합니다. 현탁액을 하룻밤 동안 배양합니다.

37 °C의 쉐이커에서 회전 쉐이커를 사용하여 적절히 혼합합니다. 하룻밤 동안 배양한 후, 가열 블록에서 100 °C로 10분 동안 가열하여 소화를 중단시킵니다. 그 다음 원심 분리하여 가용성 전분이 포함된 상층액을 제거합니다.

이전에 시연한 바와 같이 볼텍싱, 원심분리 및 데칸테이션 과정을 통해 남은 펠렛을 매회 1.5 mL의 물로 세 번 세척합니다. 마지막으로, 펠렛을 500 µL의 아세톤에 재현탁하고 35 °C의 공기 흐름을 이용하여 용매가 마를 때까지 증발시킵니다. 분리된 세포벽 또는 다리(leg), 비셀룰로오스 성분을 포함하는 건조된 시료는 추가 분석 준비가 완료되었으며 상온에서 보관할 수 있습니다.

먼저 준비된 세포벽 물질 1~1.5 mg을 정량합니다. 물질은 수동으로 정량하거나 파트 2에서 시연한 것처럼 아이월(eye wall)을 사용하여 자동 방식으로 정량할 수 있습니다. 튜브 벽을 250 µL의 아세톤으로 헹궈 세포벽 물질을 튜브 바닥에 모은 다음, 공기 흐름 하에서 아세톤을 매우 부드럽게 증발시킵니다.

아세톤이 증발한 후, 신선하게 제조한 25% volume to volume glacial acetic acid 내 acetyl bromide 100 µL를 두 벽면을 따라 천천히 가합니다. 튀는 것을 방지하기 위해 bromide를 조심스럽게 가하여 리그닌 폴리머를 아세틸화된 단당류로 분해합니다. 그런 다음 부피 플라스크의 캡을 닫고 50 °C에서 2시간 동안 가열합니다.

15분마다 4번씩 흔들어주며 1시간 더 가열하고, 마지막으로 얼음 위에서 냉각합니다. 플라스크를 실온으로 냉각한 후, 2 M 수산화나트륨 400 µL와 새로 제조한 0.5 M 하이드록실아민 염산염 70 µL를 추가하고 부피 플라스크를 볼텍싱합니다. 그다음, 빙초산을 사용하여 부피 플라스크의 2 mL 표시선까지 정확히 채워 용액을 중화시킨 후, 캡을 닫고 여러 번 뒤집어 섞습니다. 가수분해 및 가용화된 모노리스가 포함된 용액 200 µL를 피펫으로 취해 UV 전용 96-웰 플레이트에 넣고, 웰 플레이트 리더를 사용하여 280 nm에서 측정합니다. 입자로 인해 흡광도 값에 약간의 변동이 생길 수 있으므로, 플레이트를 최소 3회 측정하여 흡광도 평균값을 구합니다.

서면 프로토콜에 제시된 공식과 적절한 식물 계수를 사용하여 브롬화 수용성 리그닌(bromide soluble lignin, BSL)의 백분율을 결정하십시오. 리그닌은 주로 p-hydroxy phenol, guaiacyl, syringyl 단위의 세 가지 하위 단위로 구성된 폴리페놀 네트워크이며, 식물 재료 내 리그닌의 조성을 결정해야 합니다. 먼저 약 2 mg의 세포벽 물질을 세포 용해용 스크류 캡 유리 튜브에 옮기는 것으로 시작하십시오.

다음으로, 2.5% boron tri fluoride ethyl ate와 10% ethane thiol dioxane 용액을 준비하십시오. dioxane은 매우 위험하므로, 시료나 장비를 후드 밖으로 가지고 나가지 마십시오. 매우 주의해서 작업해야 하며, 질소 가스가 채워진 풍선을 사용하여 dioxane 병에서 소실된 부피를 질소로 대체하십시오.

샘플당 175 µL의 dioxane, 20 µL의 ETSH, 5 µL의 BF3를 혼합하여 용액을 준비합니다. 혼합 후, 각 샘플에 용액 200 µL를 첨가합니다. 바이알의 헤드스페이스를 질소 가스로 퍼지한 후 캡을 닫습니다.

즉시 샘플을 100 °C에서 4시간 동안 가열하며, 매 시간 말에 가볍게 혼합합니다. 얼음 위에서 5분 동안 반응을 중지시킵니다. 그 다음 0.4 M 중탄산나트륨 150 µL를 첨가하여 중화시킨 후 볼텍싱합니다.

리그닌 분해 산물을 정제하기 위해, 1 mL의 물과 0.5 mL의 아세테이트를 넣고 볼텍싱한 후 층이 분리될 때까지 둡니다. 에틸 아세테이트 층은 상층에, 물 층은 하층에 위치하게 됩니다. 물이 섞이지 않도록 주의하여 리그닌 성분이 포함된 상층의 에틸 아세테이트 층 150 µL를 2 mL 튜브로 옮깁니다.

상층의 에틸 아세테이트 층을 옮긴 후, 농축기를 사용하여 공기 중에서 용매를 증발시킵니다. 아세톤 200 µL를 첨가하고 증발시킵니다. 과잉의 수분을 제거하기 위해 아세톤 처리를 두 번 더 반복합니다.

다음으로 리그닌 성분을 휘발성 trimethylsilyl 유도체로 유도체화합니다. 각 튜브에 ethyl acetate 500 µL, purine 20 µL, 그리고 N,O-bis(trimethylsilyl)acetamide 100 µL를 첨가합니다. 25 °C에서 2시간 동안 배양합니다.

2시간이 지난 후, 반응액 100 µL를 GC MS 바이알로 옮기고 아세톤 100 µL를 첨가하십시오. 쿼드러플 질량 분석기(quadruple mass spectrometer) 또는 불꽃 이온화 검출기(flame ionization detector)가 장착된 GC로 시료를 분석하십시오. 컬럼 및 분석 상세 조건은 첨부된 서면 프로토콜을 참조하시기 바랍니다.

포플러 나무를 식물 재료로 사용하여 분석한 리그닌의 대표적인 결과입니다. 이 분석에 따르면, 포플러 재료의 22%가 폴리페놀 리그닌으로 구성되어 있습니다. 리그닌 성분의 조성은 GCMS를 통해 분석되었습니다.

피크는 tetra coane 내부 표준물질을 이용한 상대적 머무름 시간 또는 sg 및 h 단량체에 대해 각각 2 99 MZ, 2 69 MZ 및 2 39 MZ의 특성 질량 분석 스펙트럼 아이콘으로 식별합니다. 리그닌 성분의 조성은 총 피크 면적을 100%로 설정하여 정량화합니다. 조성 분석 결과, 이 특정 샘플은 주로 string 또는 S 단위체를 포함하고 있음을 보여줍니다. 하지만 Goya, aol 또는 G 단위체 또한 풍부하게 존재합니다.

물론, 양과 단일 단위 조성은 식물 조직과 종에 따라 다를 수 있습니다. 지금까지 다당류 분석을 위해 식물 재료의 리그닌 함량과 조성을 결정하는 방법을 보여드렸습니다. 파트 2로 넘어가십시오.

시청해 주셔서 감사합니다. 실험에 좋은 결과가 있기를 바랍니다.