Name: 塑料嵌入和非洲爪蟾胚胎切片 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-04-29T00:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 39 s
Description: 学习非洲爪蟾胚胎塑料包埋切片技术，用于发育生物学与神经科学研究。该方法可制备五微米超薄切片，保留真实组织形态，实现高分辨率免疫荧光成像。

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固定
<ol>
<li>将完整胚胎或解剖得到的外植体转移至MEMFA或3.7% FA+PBS中，置于小玻璃闪烁瓶（Fisher货号 03-339-25B）内。在室温下将瓶置于旋转摇床中孵育，仅孵育2小时，不可超过此时间。胚胎在甲醛（FA）中停留不得超过2小时。甲醛孵育时间过长会导致胚胎组织变硬，从而影响后续检测过程中抗体的渗透效果。 </li>
<li>吸除大部分甲醛溶液，加入Dent's固定液至瓶口（约4.5 ml）。轻轻倒置瓶体数次，使胚胎在Dent's固定液中充分洗涤；随后更换为另4.5 ml新鲜Dent's固定液，并于-20ºC条件下孵育至少48小时。过夜孵育不足以完成此步骤。该步骤可提高胚胎对抗体的通透性。胚胎可在该条件下保存数周。</li>
</ol>
免疫荧光
<ol>
<li>复水样本。将样本置于梯度甲醇溶液中孵育，步骤如下： 
<table style="width: 171px; height: 119px;" border="0" cellpadding="3">
<tbody>
<tr>
<td>75% MeOH/H2O</td>
<td>10min</td>
</tr>
<tr>
<td>50% MeOH/PBS</td>
<td>10min</td>
</tr>
<tr>
<td>25% MeOH/PBS</td>
<td>10min</td>
</tr>
<tr>
<td>PBS</td>
<td>10min</td>
</tr>
<tr>
<td>PBS</td>
<td>10min</td>
</tr>
</tbody>
</table>
 </li>
<li>使用60 mm塑料培养皿制备1.5%琼脂糖/PBS平板。琼脂糖凝固后，在其表面加入PBS。 </li>
<li>胚胎半切操作：将胚胎置于1.5%琼脂糖/PBS平板中。用镊子夹住一个胚胎，使用薄剃刀从胚胎中心纵向切为两半。选择切面平整且成功沿中线切开的样本。 <img src="/files/ftp_upload/old/188_2008_7_10_3/188_figure-01.jpg" alt="显示胚轴背唇位置的示意图；理想切面与不良切面对比。" width="591" height="193" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图1"> </li>
<li>将半切后的胚胎转移至含PBT的玻璃闪烁瓶中。更换为4.5 ml含20%山羊血清的PBT溶液。在摇床上室温孵育2小时（封闭步骤）。 </li>
<li>在PBT中配制适当稀释倍数的一抗溶液，每份样本需0.5 ml。例如，为研究C-cadherin在5 mm塑料切片中的亚细胞定位，我使用了1/200稀释倍数的兔抗C-cadherin多克隆抗体。 </li>
<li>吸除封闭液，加入0.5 ml稀释后的一抗溶液。将闪烁瓶直立放置于泡沫塑料管架上，在摇床上4ºC孵育过夜。 </li>
<li>移除稀释后的一抗（该溶液可在接下来的1–2周内保存并重复使用）。在室温下用4.5 ml PBT洗涤4次，每次40–60分钟。 </li>
<li>更换为0.5 ml PBT中1/100稀释的生物素标记二抗溶液。在摇床上4ºC孵育过夜。用铝箔包裹闪烁瓶以避免生物素暴露于光照。 </li>
<li>自此步骤起，需注意避免样本暴露于光线下，即将闪烁瓶置于遮光容器或铝箔中。 </li>
<li>移除生物素标记的二抗（该溶液亦可保存并在接下来的1–2周内重复使用）。在室温下用4.5 ml PBT洗涤4次，每次40–60分钟。 </li>
<li>更换为0.5 ml PBT中1/200稀释的荧光标记链霉亲和素（如FITC、Texas-red等）溶液。在摇床上4ºC孵育过夜。 </li>
<li>移除链霉亲和素溶液（也可重复使用）。在室温下用4.5 ml PBT洗涤3次，每次15–30分钟。 </li>
<li>在4.5 ml含3.7%甲醛的PBS溶液中室温固定胚胎30分钟。 </li>
<li>用4.5 ml PBS洗涤两次。 </li>
<li>脱水样本。将样本置于梯度乙醇溶液中孵育，步骤如下： 
<table style="width: 172px; height: 80px;" border="0">
<tbody>
<tr>
<td>30% EtOH/H2O </td>
<td>10 min</td>
</tr>
<tr>
<td>50% EtOH/H2O</td>
<td>10 min</td>
</tr>
<tr>
<td>75% EtOH/H2O</td>
<td>10 min</td>
</tr>
<tr>
<td>100% EtOH</td>
<td>10 min</td>
</tr>
</tbody>
</table>
 </li>
<li>样本可在4ºC避光条件下保存于100%乙醇中。</li>
</ol>
浸润
<ol>
<li>配制Technovit 7100渗透混合液。通常取15 ml基础液于50 ml锥形管中，加入150 mg硬化剂I，置于摇床上以摇动方式混合15分钟。该渗透混合液可在4°C保存最多一个月。 </li>
<li>使用渗透混合液对样本进行渗透处理，采用梯度系列的Technovit渗透混合液与乙醇（EtOH）组合进行置换，步骤如下： <ol>
<li>50% Technovit/EtOH — 1小时 </li>
<li>100% Technovit — 1小时 </li>
<li>100% Technovit — 过夜 </li>
</ol></li>
<li>样本可在100%渗透混合液中于4°C保存最多一个月。需对样本加盖，避免光照。</li>
</ol>
包埋
<ol>
<li>配制Technovit 7100包埋混合液：取0.75 ml浸润混合液至1.5 ml离心管中，加入50 µl硬化剂II。通过反复倒置离心管数次进行混匀。 </li>
<li>使用塑料移液管，将经 overnight 浸润处理的一个样本转移至0.5 ml薄壁PCR管中，吸除大部分上清液。 </li>
<li>向样本中加入0.25 ml本节第1步“包埋”中配制的包埋混合液。用钝头解剖针（木柄解剖针）轻轻推动，使剖开的胚胎切面朝向PCR管底部，以正确调整胚胎方位。 </li>
<li>盖紧管盖，将PCR管置于避光处孵育约4小时，使塑料充分聚合固化。 </li>
<li>配制Technovit 3040混合液：取1克粉末置于称量皿中，加入0.5 ml液体，立即使用蓝色枪头混匀。将混合液小心加至已固化的样本上方。此黄色的Technovit 3040可防止整个塑料块从PCR管中脱出。</li>
</ol>
切片
<ol>
<li>用二甲苯擦拭Histoknife H（乙醇通常效果不够好），然后将其安装到切片机上。将刀片角度调整至约 45°用二甲苯擦拭刀片前方的载物台区域，该区域的清洁度对切片质量至关重要。 </li>
<li>用美工刀切开管子的侧面，然后剥下管尖。 <img src="/files/ftp_upload/old/188_2008_7_10_5/188_figure-02.jpg" alt="Embryo sectioning process, Technovit embedding, diagram illustrating cut steps and materials." width="818" height="243" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 2"> </li>
<li>将样本放入切片机的卡盘中。 </li>
<li>在载玻片上贴附一个“按压密封”硅胶绝缘垫，以创建用于组织切片的封片腔室。在洁净台面上将绝缘垫牢固地按压到载玻片上，并从另一侧观察，确保绝缘垫完全贴合，无任何气泡。倒入洁净且预热的去离子水（dH₂O）。2O (~ 40°C用巴斯德移液管将液体滴加到载玻片的液滴中，直至液面达到可见其表面变平、不再呈凹面或凸面的水平。 </li>
<li>开始制作切片。进行免疫荧光研究时，我制作5 mm的切片。 原位 杂交样品的切片厚度可根据实验目的和信号强度在约 3 - 8 mm 范围内调整。 </li>
<li>用小号画笔将切片从刀片前方的载物台转移至盛有水的贴片室。将带有切片的画笔置于水面上方，用钝头解剖针轻敲使切片落入水中。切片一接触水面便会迅速展开成圆形。 </li>
<li>当封片腔的大部分水面被切片占据时，使用巴斯德移液管吸走约一半的水分。将载玻片置于载玻片加热板上过夜孵育，使样本完全干燥。 </li>
<li>用1 ml DAPI（0.1 mg/ml，溶于TE缓冲液）复染5分钟。吸除DAPI溶液，干燥样品。 </li>
<li>从载玻片上移除硅橡胶绝缘层。现在可以对样品进行拍照。将样品保存于 4°C，避光保存。</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>PBS</td><td>缓冲液</td><td></td><td></td><td>1 L 配方：8.0 g NaCl，0.2 g KCl，2.68 g Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;&amp;#183;7H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O 0.2 g KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;pH 应为 7.4。定容至 1 L。高压灭菌。</td></tr><tr><td>PBT</td><td>缓冲液</td><td></td><td></td><td>加入 0.5 mL Triton X-100 和 1.0 g BSA（分子生物学级，V 组分即可）[&amp;gt;99%]，但不要&amp;rsquo;t 使用粗制97%白蛋白）加入500 ml经高压灭菌的PBS中。用0.2 mm滤杯过滤。4℃保存&amp;#186;C.</td></tr><tr><td>&amp;#183;凹痕&amp;rsquo;固定剂</td><td>试剂</td><td></td><td></td><td>将40 mL甲醇与10 mL DMSO混合。保存于 &amp;#8211;20&amp;deg;C.</td></tr><tr><td>3.7% FA+PBS</td><td>试剂</td><td></td><td></td><td>将37%甲醛与PBS按1:9比例混合。每次使用前新鲜配制，剩余溶液丢弃。</td></tr><tr><td>辣根过氧化物酶标记的山羊抗小鼠 IgG（H+L）</td><td>Ab</td><td>Vector Laboratories</td><td>BA-9200</td><td></td></tr><tr><td>辣根过氧化物酶标记的兔IgG（H+L）二抗（山羊制备）</td><td>Ab</td><td>Vector Laboratories</td><td>BA-1000</td><td></td></tr><tr><td>免疫球蛋白&amp;rsquo;S HUADS 生物素 GTXRBT</td><td>Ab</td><td>Invitrogen</td><td>ALI3409</td><td>生物来源&amp;#8482;</td></tr><tr><td>IgG (g)，山羊抗小鼠</td><td>Ab</td><td>Invitrogen</td><td>M30115</td><td>CALTAG&amp;#8482;</td></tr><tr><td>荧光链霉亲和素试剂盒</td><td>试剂</td><td>Vector Laboratories</td><td>SA-1200</td><td>含有三种不同荧光染料标记的链霉亲和素（FITC、Texas Red 和 AMCA），适用于本实验步骤。</td></tr><tr><td>20% 山羊血清/PBT</td><td>缓冲液</td><td></td><td></td><td>这将用作封闭液。</td></tr><tr><td>小号画笔</td><td>工具</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>钝头解剖针</td><td>工具</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kulzer Technovit 7100 GMA，3040</td><td>试剂</td><td></td><td>7100 GMA，3040</td><td>甲基丙烯酸乙二醇酯</td></tr><tr><td>库尔策钨合金组织切片刀</td><td>工具</td><td>能量束科学</td><td>H1310</td><td></td></tr><tr><td>75% MeOH/H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>缓冲液</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>50% 甲醇/PBS</td><td>缓冲液</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>25% 甲醇/PBS</td><td>缓冲液</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>30% EtOH/H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;2O</td><td>缓冲液</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>50% EtOH/H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>缓冲液</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>75% EtOH/H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>缓冲液</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>100% 乙醇</td><td>缓冲液</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>小型玻璃闪烁瓶</td><td>工具</td><td>Fisher Scientific</td><td>03-339-25B</td><td></td></tr><tr><td>0.5 mL 薄壁 PCR 管</td><td>工具</td><td>分子生物产品</td><td>3430</td><td></td></tr><tr><td>按压密封硅橡胶绝缘子</td><td>工具</td><td>Grace Bio-Lab 公司</td><td>JTR1L-2.5</td><td>32 mm 长 × 19 mm 宽，2.5 mm 厚</td></tr><tr><td>薄刃剃刀</td><td>工具</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PBS 中的 1.5% 琼脂糖</td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="5">针对抗原或表位标签的一抗：用PBT配制适当稀释度。 
生物素偶联的二抗：多家供应商提供生物素偶联抗体。</td></tr></tbody></table>

非洲爪蟾胚胎的塑料包埋与切片

Plastic Embedding and Sectioning of Xenopus laevis Embryos

塑料切片可在组织的薄切片中保持真实的组织形态，并可用荧光二抗进行免疫染色，因此该方法在多种组织类型中比石蜡包埋或冷冻切片更为实用。本视频展示了染色、塑料包埋及切片的方法。

大家好，我叫Sochi ota。我是加州大学发育与细胞生物学系Ken Cho博士实验室的一名博士后科学家。今天，我将向大家演示如何制备非洲爪蟾胚胎的简化切片。该实验步骤包括对晚期囊胚期蛙胚胎进行切半处理，使用针对目标分子的抗体进行染色，随后将样本浸入塑料包埋剂中，并制作五微米厚的塑料切片。该方法可用于高分辨率的免疫荧光、免疫组织化学或原位杂交成像研究。这些是我用于处理十枚以上胚胎塑料切片的小型实用工具。这是一种带有三角尖头的金属镊子，其作用之一是可以用于在塑料中调整胚胎的方向。作用之二是可与这支画笔配合使用，将胚胎从切片机转移至载片表面。这是一个硅橡胶绝缘垫，我将其放置在载玻片表面，用以形成一个水膜区域，以便固定塑料切片后的胚胎切片。现在我将演示如何对胚胎进行切半处理，适用于原位杂交或免疫荧光检测等实验的固定胚胎。为了将胚胎切成两半，我使用这种非常超薄的细孔滤网，你可以在杂货店购买到。我认为是的，胚胎已在3.7%多聚甲醛中固定过夜。而如何固定取决于实验目的。这种固定方式需要过夜。对于切口杂交而言，可以进行过夜固定；但对于免疫荧光检测（即检测胚胎内部蛋白质）则不建议固定时间过长。我倾向于仅用3.7%甲醛固定液固定两小时，以尽量减少对蛋白质亚细胞定位的影响，同时避免过度固定，从而在检测步骤中有利于抗体的良好渗透。好的，现在我正通过切开囊胚壁的左侧和右侧来解剖这个胚胎。现在我可以看到这是一个11期胚胎，其中成体细胞（PO）从背侧一直延伸到腹侧，但这是个异常的胚胎。让我们来看一下这个右侧的部分。你可以在背侧和腹侧都观察到原肠胚的外凸结构，但背侧更为明显，因为与腹侧相比，此处的内陷已明显达到胚胎内部最深的位置。因此，这是一个很好的切开样本，可用于同时研究背侧和腹侧。在胚胎内部，即这个已解剖的胚胎中，我将采用免疫荧光检测技术来检测胚胎内表达的蛋白质。进行免疫荧光或免疫组织化学检测时，需使用特异性抗体进行检测。但问题是，抗体难以有效穿透到胚胎内部。因此，如果你使用整体胚胎样本，就无法研究目标蛋白在胚胎内部细胞中的表达模式。但通过使用预先切开的胚胎样本，你可以研究胚胎深层细胞中蛋白的表达模式。啊，已染色的胚胎已经用3.7%甲醛固定，并经乙醇脱水，随后浸入一种名为Technovit 7100的塑料介质中。该试剂盒包含三个部分：主要液体成分、称为硬化剂一的粉末，以及称为硬化剂二的液体。首先，我将主体部分与固化剂按100比1的比例混合，得到浸润混合液。这种液体用于浸润胚胎。此时混合物仍为液态，尚未固化。将这些胚胎样本在渗透混合液中过夜孵育，以确保胚胎样本完全被该塑料包埋。现在，我用移液器取出其中一个样本胚胎，并转移至薄壁0.5 mL PCR管中，该管用作包埋模具。然后，从该胚胎中去除多余的液体。现在，这个胚胎已经可以包埋在固化塑料中了。制备固化塑料时，需将渗透液与固化剂按15:1

plastic-embedding-and-sectioning-of-xenopus-laevis-embryos

Research

科研

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Biology

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