חילוץ ה-DNA של חיידקים במעיים של טרמיטים (Zootermopsis Angusticollis) באופן חזותי חיידקים גוט

כאן, התגובה שלך לסביבה הזו היא לא, היא לא ייחודית. רוב האנשים, אפילו שאינם מדענים, די מפוצצים. כן. על ידי, המגוון והמורכבות.

היי, שמי אריק מטסון ואני פוסט-דוקטורנט במחלקה להנדסת סביבה ומדע כאן במכון הטכנולוגי של קליפורניה. עבודתי בהנחייתו של פרופסור ג'ארד לדבטר מתמקדת באינטראקציות מיקרוביאליות ובמגוון המינים המאכלסים את המעי האחורי של הטרמיטים. בפרט, אנו מתעניינים בכמה מהמסלולים הביוכימיים שמתרחשים, ובמיוחד מתעניינים בתהליך של אגנזה של אס, שבו המיקרובים האלה צורכים גזי מימן ו-CO2 וממירים אותם לאצטט, שהוא חומר מזין מרכזי בחילוף החומרים האנרגטי של הטרמיטים המארח.

אני ואחרים במעבדה פיתחנו ערכות פריימר ממוקדות כדי להיות מסוגלים להיכנס ולהעריך אנזימים מרכזיים במסלול זה. אך על מנת לעשות זאת, אנו נדרשים לייצר דגימות דנ"א נקיות של הקהילה הקהילתית, הדנ"א, על מנת להשתמש בהן כמטרות לתהליך זה. אז היום רציתי להדגים איך אנחנו מנתחים את מיני הטרמיטים שאנחנו מדברים עליהם, מחלצים את הדנ"א מהמעי האחורי ואז מטהרים אותו ומשתמשים בו מאוחר יותר למחקרים.

היום נתמקד במין אחד של טרמיטים, במיוחד שנקרא Zo Opsis Nevadensis. זהו טרמיט עץ לח בקליפורניה שנאסף כאן באופן מקומי, וזהו מין גדול למדי, מה שמקל למדי על ביצוע הנתיחות והחילוץ ממנו. אוקיי, אז היום כבר הכנתי חלק מהאספקה שנצטרך להליך.

אחד הדברים הראשונים שאנחנו צריכים הוא, כמות מסוימת של קרח כדי לצנן את החרקים שינתחו. ציננתי מראש גם קצת מאגר TE, וזה מכיל תרכובת שתעזור לייצב את ה-DNA ברגע שהוא ישתחרר מהתאים כאן. יש לי בקבוקונים סטריליים טעונים מראש בחרוזי זירקון זירקוניה סיליקט.

אלה חרוזים של 0.1 מילימטר ויש כאן בערך חצי גרם בערך. זה מה שנעשה בפועל, גזירה מכנית. ואז יש לי כמה ריאגנטים המעורבים בהליך הליזיס והטיהור.

הנה יש לי בקבוק המכיל 1% פוליוויניל PolyOne או PVPP במאגר. ה-PVPP חשוב להסרת חומצות הומיות מהכנת ה-DNA, מה שיכול לעכב את ניתוח ה-PCR שלנו של התוצאות. ואז יש לי קצת נתרן ECCO סולפט, שהוא חומר פעילי שטח שנשתמש בו כדי לעזור לחלץ ולשבש את התאים.

ואז כדי לבצע את הניתוח של הטרמיטים, כל מה שאנחנו צריכים זה כמה מלקחיים סטריליים. אלה בעלי קצה עדין למדי וזה מה שנשתמש בו למעשה כדי להסיר את עקבות המעיים ממנו. ולבסוף, כדי לבצע את הגזירה המכנית, יש לנו כאן מכשיר הכאת דבורים שמסתובב בסל"ד גבוה מאוד והוא, יחד עם חרוזי זירקוניה סיליקט, יגרום לשיבוש מכני של התאים.

אז אחרי שאספנו את הטרמיטים בשטח, אנחנו מחזירים אותם למעבדה. רוב טרמיטי העץ הלח בקליפורניה שאנו עובדים איתם מועדים מאוד להתייבשות. אז אחת ההתקדמות שעשינו במעבדה הזו היא לשלב את השימוש בתאים מבוקרי לחות, כמו מיכלי הדגים האלה של 10 ליטר.

בפנים כאן, אנו אוספים את המושבות הבודדות ושומרים אותן מופרדות באלה, בקופסאות האלה. ובבסיס המיכל נמצאים בעצם מיכלים בעלי תמיסות מלח שונות. הספציפי הזה מכיל תמיסה של אשלגן פוספט, השומר על הלחות היחסית סביב 95 עד 96% וזה מושלם.

ועם התנאים האלה, הטרמיטים למעשה מתרבים בשבי, אבל כשאנחנו רוצים ללכת ולערוך ניסוי, אנחנו אוספים טריים מהשדה. אבל בקופסה הזו אתה יכול לראות חלק מהעץ שהם ניזונים ממנו. זה רק פונדרוסה או ג'פרי פיין שאנו אוספים באתר קן הטרמיטים.

ויש מספר הטלות טרמיטים שונות, כולל הרבייה הזכרית והנקבית. רוב המושבה מורכבת מטרמיטים פועלים עם מספר של יציקות חיילים. מעניין שלחיילים יש לסתות תחתונות שנועדו להגן על המושבה ולא לאכול את העץ.

ולכן הם תלויים בטרמיטים הפועלים כדי להאכיל גם אותם. וכך תוכלו לראות בקופסה הזו גם טרמיטים פועלים וחיילים וגם כמה צעירים שבקעו לאחרונה מביצים. ובכן בשבי כאן.

אז בחרתי חמישה טרמיטים עובדים מתוך הקבוצה שהראיתי לכם זה עתה. והתחלתי לצנן אותם על קרח כאן. כדי להתכונן לדיסקציה, אני הולך להשתמש במלקחיים האלה ולעבוד בעזרת טווח ניתוח, ואני מקווה שתוכלו לראות את נפח המעיים הגדול שנוכל להסיר מכל אחד מהפרטים האלה.

פשוט הפוך את הטרמיט על גבו ועם מלקחיים אחד, אתה מחזיק את קצה הראש ועם השני, כל מה שאתה עושה זה לצבוט. ממש בקצה הבטן כאן. ועם קוטב אחד, אתה אמור לראות את מערכת העיכול מוסרת מהאורגניזם. בסדר.

ואתם יכולים לראות שהנפח הגדול, בערך 30%40% ממשקל החרק למעשה, מוכל למעשה בתוך הסביבה הזו שם. ואתם יכולים לראות שהוא מחולק למספר חלקים. יש לנו את ארבעת המעיים ואז את המעי האמצעי, ואז את האגרוף האחורי הזה, שהוא החדר הגדול מאוד שמכיל את רוב האוכלוסייה המיקרוביאלית שמבצעת את התסיסות.

אז הנה הסרתי את המעיים של חמישה טרמיטים עובדים. ועכשיו השלב הבא הוא לייצב את חומצות הגרעין הכלולות בתוך הקהילה כאן בתמיסה של חוצץ קר כקרח. בשלב זה, ניתן להקפיא אותם במינוס 20 מעלות צלזיוס אם אתה עובד בשדה.

או שאנחנו יכולים להמשיך ישר עם הליך החילוץ. אבל כל התאים וחומר הדנ"א עדיין כלולים בתוך המעיים. ואני פשוט הולך לשים אותם ב-100 מיקרוליטר של מאגר טה.

אוקיי, לפני שאני מתחיל לחלץ את דגימות המעיים, אני צריך להכין את המאגר שבו אני הולך להשתמש כדי לשבש את התאים והרקמות פנימה. אז לצינור הזה שכבר יש לי בערך חצי גרם של חרוזי זירקון, אני הולך להוסיף PVPP 700 מיקרוליטר מזה. זהו המאגר של 1% ב-te ו-50 מיקרוליטר של תמיסה של 20% של SDS.

חשוב להשעות מחדש את ה-PVPP לפני הוספתו מכיוון שהוא אינו מסיס במאגרים מימיים. בשלב זה, אנו מוכנים להוסיף את הפנול לדגימה, אז אני הולך להשתמש בפיפטה כדי להוסיף כ-500 מיקרוליטר בערך. בסדר. ועם זה, אנחנו מוכנים להתחיל את החילוץ. כן.

עם תוספת הפנול, אנו מוכנים להוסיף את דגימת המעיים שניתחנו מהטרמיט קודם לכן, כך שהיא עוזרת להשרות את הרקמות רק מעט. זה נוטה להפוך את ההעברה לקלה במקצת. ועכשיו עם הוספת הפנול, אנו מוכנים להתחיל את השיבוש המכני עם מכשיר חרוזי החרוזים.

הטכניקה שבה נשתמש היא שלושה מחזורים במלוא המהירות, 30 שניות, ואחריהם 30 שניות על הקרח. חשוב לשלב את המדרגה על הקרח כדי לקרר את הדגימה מכיוון שהיא נוטה להתחמם בגלל חיכוך. אז אני פשוט אכניס את הדגימה למכשיר חרוזי החרוזים כאן, ואני אלך ל-30 שניות. בסדר.

בסוף ההליך, אתה אמור לראות שרוב הרקמה עברה הומוגניזציה. אמורים להישאר מעט מאוד גושים, ותראה שזה, יש לו מראה קצף כנראה בגלל ה-SDS שם. בשלב זה, אנו מוכנים לצנטריפוגה ואז להתחיל בטיהור המיצוי בפועל של הדנ"א עצמו מהדגימה הזו.

כעת, לאחר ששיבשנו את התאים באופן מכני, אנו הולכים לצנטריפוגה החוצה את החומר הבלתי מסיס. נעשה זאת על ידי הכנסת הצנטריפוגה ושימוש בכוח הכבידה פי 8,000 למשך דקה אחת. ועכשיו מה שאנחנו מצפים לראות הוא רוב החומר המסיס שנאסף ליד תחתית הצינור.

ומה שמעניין אותנו הוא התמיסה המימית בחלק העליון. וזה מה שנוסיף למעשה לערכת מיצוי ה-DNA של KaiGen בעקבות ההליך של ליזאט גולמי. עכשיו כשיש לנו את צנטריפוגת הדגימה שלנו, אנחנו הולכים לקחת 200 מיקרוליטר לכל תכשיר של הסופרנטנט, ואנחנו הולכים לחלץ את הדנ"א רק באמצעות ערכת A-D-N-E-Z KaiGen תוך שימוש בפרוטוקול המצוין עבור ליזאט גולמי.

עכשיו יש לנו 200 מיקרוליטר של דגימת מעיים, ואני מתכוון להמשיך להשתמש בערכת kyogen d easy תוך שימוש בפרוטוקול המצוין עבור ליזאט גולמי. בכל פעם שאנו מבצעים מיצוי מעיים, תמיד כדאי לבדוק את מצב תכולת המעי. אז אנחנו עושים את זה על ידי ניתוח טרמיט ופשוט מוודאים שהוא מייצג דברים שראינו בעבר.

למעשה נעשה זאת באופן ויזואלי על ידי התבוננות בתאים בקהילה המיקרוביאלית הזו. ממש בקצה הבטן כאן. ועם מוט אחד, אתה אמור לראות את מערכת העיכול.

אז זו רק תמיסת מלח חוצצת שתואמת מאוד את הרכב נוזל המעיים האמיתי של הטרמיט. ואני רק הולך להרחיב את זה קצת ואז אוסיף את זה לשקופית המיקרוסקופ ונסתכל. אוקיי, עכשיו אנחנו מוכנים להסתכל על זה במיקרוסקופ.

כן, זה נראה ממש טוב. מעי טרמיטים. ישנם נציגים של כל שלושת תחומי החיים המוכרים.

יש פרוטוזואה איקריוטית, יש אורגניזמים של מת', ויש גם חיידקים. והמעבדה שלנו עוסקת בעיקר באוכלוסיית החיידקים בסביבה זו. כלומר, ה-SPI kes בסוג מסוים זה של צריח טרמיטים הם בין הדומיננטיים ביותר מבין חברי החיידקים בקהילה.

והמחקר הנוכחי שלנו מראה שלמעשה הם אכן עוסקים במידה רבה בהפחתת CO2 בקטוגנזה. אז אלה, אלה הם רק סוגים שונים של פרוטוזואה, והם נחשבים כמשתתפים, כלומר, ב, בפירוק הראשוני של העץ. אז חושבים שהם מכילים שין AEs וצלולאז, שמאפשרים לאנזימים שלהם גישה לפולימרי העץ האלה.

ואז הם, הם מתסיסים אותם למונומרים מונו-סוכר ופולימרים שמתפרקים עוד יותר על ידי חברים אחרים בקהילה. והפרוטוזואה הללו גם מייצרות אצטט בעצמן, אבל, אבל אחד מתוצרי הלוואי שלהם הוא מימן ו-CO2 והמימן וה-CO2 הזה שוב, הוא מה שמשמש או נצרך על ידי אוכלוסיות האצטו בסביבה זו. וכאן אתם יכולים פשוט לראות נחיל של, של אורגניזמים של פרוטוזואה, כנראה ממש ליד מין גדול מאוד של טריק ואינפה שם.

זהו אחד האורגניזמים הגדולים ביותר במעיים של טרמיטים. כשאתה יורד למטה ואתה מסתכל על אזורים שאינם מכילים את תאי הפרוטוזואה הגדולים האלה, אתה תראה שהרקע הוא שסוג זה של נוזל ביניים טעון גם ב-spi, keets ותאי חיידקים אחרים. וכך, אתם יודעים, המורכבות לא נעשית פחות אפילו בתחומים האלה.

אחד הדברים שעליי לציין הוא שהנפח האופייני של אגרוף המעי האחורי, כמו זה שבדקנו כאן, הוא בין שניים לחמישה מיקרוליטרים בהתאם לגודל הטרמיט. ולכן ההכנה להרכבה הרטובה שעשיתי כאן באמת מייצגת לפחות דילול של 1 עד 20 של הסביבה הזו. וכך למעשה המינים הללו ארוזים הרבה, הרבה יותר צפופים במעיים השלמים מאשר מה שמיוצג כאן.

אז זה נותן לך מושג כלשהו על הצפיפות כמו גם על המגוון של החיים בסביבה הזאת, בסביבה הזאת. אז היום הראיתי לכם כיצד אנו מבודדים את הדנ"א ממעיים של טרמיטים עם הדגימות המטוהרות הללו. עכשיו נוכל ליישם את ערכות הפריימר הממוקדות הספציפיות.

כלומר, אנחנו הולכים לבחון גנים ליצירת דהידרוגנאז, פחמן חד חמצני דהידרוגנאז וסינתזה פורמלית של טטרה הידרו פולאט, שהם שלושה מתוך ערכות הפריימר שהמעבדה שלנו פיתחה. אנו מעוניינים לחקור את המגוון ומאפייני הרצף הספציפיים של מספר גנים שונים אלה עבור סביבה זו. אז זה יהיה כרוך ב-PCR להגביר את הגנים השונים, לשכפל אותם, לרצף אותם ולבנות מלאי גנים.

בהתבסס על התוצאות, אנו יכולים ללמוד משהו על האופי של חלק מהאינטראקציות האלה, ובאופן ספציפי כיצד המסלולים האלה נבנים במיקרואורגניזמים השונים האלה באמצעות התהליך הזה.