Termit Gut Mikroplar (Zootermopsis Angusticollis) DNA ayıklanıyor ve Gut Mikroplar görselleştirme

Burada, bu ortama tepkiniz benzersiz değil, benzersiz değil. Çoğu insan, hatta bilim adamı olmayanlar bile, oldukça şaşırmış durumda. evet. Tarafından, çeşitlilik ve karmaşıklık.

Merhaba, benim adım Eric Matson ve California Institute of Technology'de Çevre ve Bilim Mühendisliği Bölümü'nde doktora sonrası araştırmacıyım. Profesör Jared Ledbetter yönetimindeki çalışmam, termit arka bağırsağında yaşayan türlerin mikrobiyal etkileşimlerine ve çeşitliliğine odaklanıyor. Özellikle, devam eden bazı biyokimyasal yolaklarla ilgileniyoruz ve özellikle bu mikropların hidrojen ve CO2 gazlarını tükettiği ve bunları termit konakçısının enerji metabolizmasının önemli bir besin maddesi olan asetata dönüştürdüğü ace agenezisi süreciyle ilgileniyoruz.

Ben ve laboratuvardaki diğer kişiler, bu yoldaki anahtar enzimleri değerlendirebilmek ve değerlendirebilmek için hedefe yönelik primer setleri geliştirdik. Ancak bunu yapabilmek için, bu süreç için hedefler için kullanmak üzere topluluk topluluğunun, DNA'nın temiz DNA örneklerini oluşturmamızı gerektirir. Bu yüzden bugün, bahsettiğimiz termit türlerini nasıl parçalara ayırdığımızı, DNA'yı arka bağırsaktan nasıl çıkardığımızı ve daha sonra araştırmalar için kullanmak üzere nasıl saflaştırdığımızı göstermek istedim.

Bugün, özellikle Zo Opsis Nevadensis adı verilen bir termit türüne odaklanacağız. Bu, burada yerel olarak toplanan bir Kaliforniya nemli ahşap termitidir ve oldukça büyük bir türdür, bu da diseksiyonları ve ekstraksiyonları yapmayı oldukça kolaylaştırır. Tamam, bugün prosedür için ihtiyaç duyacağımız bazı malzemeleri zaten hazırladım.

İhtiyacımız olan ilk şeylerden biri, diseksiyona uğrayacak böcekleri soğutmak için belirli bir miktar buzdur. Ayrıca bir miktar TE tamponunu önceden soğuttum ve bu, buradaki hücrelerden salındıktan sonra DNA'yı stabilize etmeye yardımcı olacak bir bileşik içeriyor. Zirkon zirkonya silikat boncuklarla önceden yüklenmiş steril şişelerim var.

Bunlar 0.1 milimetrelik boncuklar ve burada yaklaşık yarım gram kadar var. Aslında yapacağımız şey bu, mekanik kesme. Ve sonra lizis ve saflaştırma prosedüründe yer alan birkaç reaktifim var.

Burada te tamponunda %1 polivinil PolyOne veya PVPP içeren bir şişem var. PVPP, DNA preparatlarından hümik asitlerin çıkarılması için önemlidir, bu da sonuçların PCR analizimizi engelleyebilir. Ve sonra elimde biraz sodyum ECCO sülfat var, bu da hücreleri çıkarmak ve bozmak için kullanacağımız bir yüzey aktif madde.

Ve sonra termitlerin diseksiyonunu yapmak için ihtiyacımız olan tek şey steril bir forseps. Bunlar oldukça ince uçludur ve aslında bağırsak izlerini çıkarmak için kullanacağımız şey budur. Ve son olarak, mekanik kesme işlemini yapmak için, burada çok yüksek RPM'lerde dönen bir arı dövme cihazımız var ve bu, zir zirkonya silikat boncuklarla birlikte, hücrelerin mekanik olarak parçalanmasını yapacak.

Termitleri tarlada topladıktan sonra, onları laboratuvara geri getiriyoruz. Birlikte çalıştığımız Kaliforniya nemli ahşap termitlerinin çoğu kurumaya çok eğilimlidir. Bu laboratuvarda yaptığımız ilerlemelerden biri, bu 10 galonluk balık tankları gibi nem kontrollü odaların kullanımını dahil etmektir.

Buranın içinde, tek tek kolonileri topluyoruz ve onları bu kutularda, bu kutularda ayrı tutuyoruz. Ve tankın tabanında temel olarak farklı tuz çözeltilerine sahip kaplar bulunur. Bu özel olan, bağıl nemi %95 ila 96 arasında tutan bir potasyum fosfat çözeltisi içerir ki bu mükemmeldir.

Ve bu koşullarla, termitlerin esaret altında üremesini sağladık, ancak gidip gerçekten bir deney yapmak istediğimizde, tarladan taze topluyoruz. Ancak bu kutuda besledikleri odunların bir kısmını görebilirsiniz. Bu sadece termit yuvasının bulunduğu yerde topladığımız Ponderosa veya Jeffrey Pine.

Ve erkek ve dişi üremeler de dahil olmak üzere bir dizi farklı termit dökümü vardır. Koloninin çoğu, asker dökümlerinin sayısı da dahil olmak üzere işçi termitlerden oluşur. İlginç bir şekilde, askerlerin odun yemekten ziyade koloniyi savunmak için tasarlanmış ağız kısımları mandibulaları vardır.

Ve böylece onları beslemek için işçi termitlere de bağımlıdırlar. Ve bu kutuda hem işçileri hem de asker termitleri ve yumurtadan yeni çıkmış bazı yavruları görebilirsiniz. Burada esaret altında.

Ben de yaptım, bu yüzden size az önce gösterdiğim gruptan beş işçi termit seçtim. Ve burada onları buz üzerinde soğutarak başladım. Diseksiyona hazırlanmak için, bu forsepsleri kullanacağım ve bir diseksiyon dürbünü yardımıyla çalışacağım ve umarım bu bireylerin her birinden çıkarabileceğimiz büyük bağırsak hacmini görebileceksiniz.

Termiti sırtüstü çevirin ve bir forsep ile baş ucunu tutarsınız ve diğeriyle tek yapmanız gereken çimdiklemek. Burada karnın hemen ucunda. Ve bir kutupla, bağırsak yolunun organizmadan çıkarıldığını görmelisiniz. Tamam.

Ve gördüğünüz gibi büyük hacim, böceğin ağırlığının kabaca %40'ı aslında, o ortamın içinde bulunuyor. Ve birkaç bölüme ayrıldığını görebilirsiniz. Dört bağırsağımız var, sonra orta bağırsak, ve sonra bu arka bağırsak yumruğu, fermantasyonları gerçekleştiren mikrobiyal topluluğun çoğunu, çoğunu içeren çok büyük odacık.

İşte burada beş işçi termitin bağırsaklarını çıkardım. Ve şimdi bir sonraki adım, buradaki topluluk içinde bulunan nükleik asitleri buz gibi soğuk bir tampon çözeltisinde stabilize etmektir. Bu noktada, tarlada çalışıyorsanız eksi 20 santigrat derecede dondurulabilirler.

Ya da doğrudan ekstraksiyon işlemine devam edebiliriz. Ancak tüm hücreler ve, ve ve DNA materyali hala bağırsakta bulunur. Ve onları sadece 100 mikrolitre te tamponuna koyacağım.

Tamam, bağırsak örneklerini çıkarmaya başlamadan önce, içindeki hücreleri ve dokuları parçalamak için kullanacağım tamponu hazırlamam gerekiyor. Zaten yarım gram zirkon boncuğum olan bu tüpe bundan PVPP 700 mikrolitre ekleyeceğim. Bu, %1'lik tampon ve %20'lik bir SDS çözeltisinin 50 mikrolitresidir.

Sulu tamponlarda çözünmediği için PVPP'yi eklemeden önce yeniden askıya almak önemlidir. Bu noktada, fenolü numuneye eklemeye hazırız, bu yüzden yaklaşık 500 mikrolitre eklemek için bir pipet kullanacağım. Tamam. Ve bununla, çıkarmaya başlamaya hazırız. evet.

Fenol eklendiğinde, daha önce termitten ayırdığımız bağırsak örneğini eklemeye hazırız, bu yüzden dokuları biraz yumuşatmaya yardımcı olur. Aktarımı biraz daha kolaylaştırma eğilimindedir. Ve şimdi fenol eklendiğinde, boncuk boncuklama cihazıyla mekanik bozulmaya başlamaya hazırız.

Kullanacağımız teknik, tam hızda üç döngü, 30 saniye ve ardından buz üzerinde 30 saniye. Sürtünme nedeniyle ısınma eğiliminde olduğundan, numuneyi soğutmak için buz üzerindeki basamağı dahil etmek önemlidir. Bu yüzden numuneyi buradaki boncuk boncuklama cihazına yerleştireceğim, Ve 30 saniye boyunca gideceğim. Tamam.

İşlem sonunda dokunun büyük bir kısmının homojenize edildiğini görmelisiniz. Çok az küme kalmış olmalı ve muhtemelen oradaki SDS nedeniyle biraz köpüklü bir görünüme sahip olduğunu göreceksiniz. Bu noktada, santrifüjlemeye ve ardından bu örnekten DNA'nın kendisinin gerçek ekstraksiyon saflaştırılmasına başlamaya hazırız.

Şimdi hücreleri mekanik olarak bozduğumuza göre, çözünmeyen materyali santrifüj edeceğiz. Bunu, santrifüjü koyarak ve bir dakika boyunca 8.000 kez yerçekimi kullanarak yapacağız. Ve şimdi görmeyi beklediğimiz şey, tüpün dibine yakın bir yerde toplanan çözünür materyalin çoğu.

Ve bizim ilgilendiğimiz şey en üstteki sulu çözelti. Ve bu, ham lizat prosedürünü takiben KaiGen DNA ekstraksiyon kitine gerçekten ekleyeceğimiz şeydir. Artık örnek santrifüjümüze sahip olduğumuza göre, süpernatantın hazırlanması başına 200 mikrolitre alacağız ve DNA'yı sadece A-D-N-E-Z KaiGen kitini kullanarak ham lizat için belirtilen protokolü kullanarak çıkaracağız.

Şimdi 200 mikrolitre bağırsak örneğine sahibiz ve ham lizat için belirtilen protokolü kullanarak kyogen d easy kitini kullanmaya devam edeceğim. Ne zaman bir bağırsak ekstraksiyonu yapsak, bağırsak içeriğinin durumunu kontrol etmek her zaman iyi bir fikirdir. Bunu, bir termiti parçalara ayırarak ve sadece geçmişte gördüğümüz şeyleri temsil ettiğinden emin olarak yapıyoruz.

Aslında bunu görsel olarak bu mikrobiyal topluluktaki hücrelere bakarak yapacağız. Burada karnın hemen ucunda. Ve bir direkle bağırsak yolunu görmelisiniz.

Yani bu sadece, termitin gerçek bağırsak sıvısının bileşimine çok yakından uyan tamponlu bir tuz çözeltisidir. Ve bunu biraz yumuşatacağım ve sonra mikroskop slaytına ekleyeceğim ve bir göz atacağız. Tamam, şimdi buna mikroskopta bakmaya hazırız.

Evet, bu gerçekten iyi görünüyor. Termit bağırsağı. Tanınmış üç yaşam alanının da temsilcileri vardır.

Ökaryotik protozoalar var, bir metamfetamin organizmaları var ve bir de bakteriler var. Ve laboratuvarımız ağırlıklı olarak bu ortamdaki bakteri popülasyonu ile ilgileniyor. Yani, bu özel termit sivri uçlu keet türündeki SPI kes, topluluğun bakteri üyelerinin en baskın olanları arasındadır.

Ve şu anki araştırmamız, aslında CO2 indirgeyici bir ketogenez ile büyük ölçüde meşgul olduklarını gösteriyor. Yani bunlar, bunlar sadece çeşitli farklı protozoa türleri, ve onların ahşabın birincil parçalanmasına katıldıkları düşünülüyor. Bu yüzden, enzimlerinin bu ahşap polimerlere erişmesine izin veren xin AE'leri ve selülaz içerdikleri düşünülüyor.

Ve sonra onlar, bunları mono şeker monomerlerine ve ve topluluğun diğer üyeleri tarafından daha da parçalanan polimerlere fermente ederler. Ve bu protozoalar kendileri de asetat üretirler, ama, ama yan ürünlerinden biri hidrojen ve CO2'dir ve bu hidrojen ve CO2 yine bu, bu ortamdaki aseto popülasyonları tarafından kullanılan veya tüketilen şeydir. Ve burada sadece bir protozoa organizma sürüsü görebilirsiniz, muhtemelen çok büyük bir türün hemen yanında, hile ve infa orada.

Termit bağırsağındaki en büyük organizmalardan biridir. Aşağıya indikçe ve aslında bu büyük protozoa hücrelerini içermeyen alanlara baktığınızda, arka planın bu tür bir interstisyel sıvının spi, keets ve diğer bakteri hücreleriyle dolu olduğunu göreceksiniz. Ve böylece, bilirsiniz, karmaşıklık bu alanlarda bile daha az olmaz.

Dikkat çekmem gereken şeylerden biri, burada baktığımız gibi arka bağırsak yumruğunun tipik hacminin, termitin boyutuna bağlı olarak iki ila beş mikrolitre arasında herhangi bir yerde olmasıdır. Ve burada yaptığım ıslak montaj hazırlığı, o ortamın gerçekten en az bir ila 20 oranında seyreltilmesini temsil ediyor. Ve aslında bu türler, burada temsil edilenden çok, çok daha yoğun bir şekilde gerçek bozulmamış bağırsakta paketlenmiştir.

Bu size, bu ortamdaki yaşamın çeşitliliğinin yanı sıra yoğunluğu hakkında da bir fikir verir. Bugün size bu saflaştırılmış örneklerle DNA'yı termit bağırsağından nasıl izole ettiğimizi gösterdim. Şimdi belirli hedeflenen astar setlerini uygulayabileceğiz.

Yani, bir dehidrojenaz, karbon monoksit dehidrojenaz ve resmi tetra hidro folat sentezi için genlere bakacağız, ki bunlar laboratuvarımızın geliştirdiği primer setlerinden üçüdür. Bu çevre için bu farklı genlerin bir kısmının çeşitliliğini ve spesifik dizi özelliklerini incelemekle ilgileniyoruz. Bu, PCR'nin farklı genleri çoğaltmasını, klonlamasını ve dizilemesini ve gen envanterleri oluşturmasını içerecektir.

Sonuçlara dayanarak, bu etkileşimlerin bazılarının doğası ve özellikle bu yolların bu süreç boyunca bu farklı mikroorganizmalarda nasıl oluşturulduğu hakkında bir şeyler öğrenebiliriz.