Name: Primaire neuronale culturen uit de hersenen van laat stadium Drosophila Poppen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-05-28T00:00:00.000+00:00
Duration: 15 min 12 s
Description: Leer primaire neuronale culturen bereiden uit de hersenen van laat stadium Drosophila poppen. Deze methode toont neurietuitgroei en calciumbeeldvorming met Fura-2 voor onderzoek naar neuronale ontwikkeling en activiteit.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Dit werk werd ondersteund door NIH subsidie ​​NS27501 naar DKOD. Extra ondersteuning voor dit werk werd geleverd door een subsidie ​​aan UC Irvine ter ondersteuning van DKOD via de HHMI Professor Program.

Voorbereidingen voor de dag van het kweken: <ol><li> Maak steriele ontleden oplossing. </li><li> Maak steriel DMEM en te houden in 10 ml bij 4 ° C gedurende 2 weken. </li><li> Maak steriel DDM2 supplementen en vries in 50 of 100 ul porties voor 1 maand. </li><li> Maak ConA / laminine. </li><li> Vacht dekglaasjes. Optioneel: Maak steriele CNBM en op te slaan ingevroren voor maximaal 4 maanden. </li></ol> Op de dag van het kweken van I. Bereid Enzyme Solution (ES) in laminaire flow hood <ol><li> Doe 5 ml ontleden oplossing (DS) in een 15 ml centrifugebuis. </li><li> Weeg 0,8 mg van L-cysteïne in een 0,6 ml Eppendorf en voeg 150 ul van de DS. Pipet op en neer tot er kristallen zijn verdwenen. </li><li> Voeg 150 ml van de DS / Cysteïne om de 5 ml DS en meng goed. </li><li> Voeg 50 U (eenheden) van papaïne. </li><li> Voeg 7 ml 0,1 N Na OH en meng goed. Oplossing zal duidelijk binnen 30 minuten. wanneer geactiveerd. </li><li> Filter enzym oplossing met 0,2 mm spuit filter in een steriele 1,5 ml schroefdop microfugebuisje Papaïne: Wil je 50 E in 5 ml DS. Elke partij is iets anders, dus moeten berekenen hoeveel: 37,3 mg / ml en 28,3 U / mg 37,3 x 28,3 = 1055,59 U / ml (1000 ml) 50 U = 47,4 ml </li></ol> II. Maak DDM2 media Op de dag van het kweken: voeg de volgende aanvullingen op DDM2 maken Tot 10 ml van DMEM voeg de supplementen, net voor het kweken van: <ol><li> 100μl Transferrine </li><li> 100μl putrescine </li><li> 100μl Selenium </li><li> 100μl Progesteron </li><li> 50μl Insuline </li><li> 10μl 20-hydroxyecdyson </li></ol> Let op: Maak genoeg DDM2 voor de geplande alle culturen (elk brein uitgeplaat op een dekglaasje in een individueel 35 mm petrischaal, 1,5 ms van de media / cultuur) Stap III-VI kan op een niet-steriele lab gedaan bank en moet worden voltooid in 45 minuten of minder. III. Poppen Collection <ol><li> Kies 10-15 poppen uit zijden van flacon onder een dissectie microscoop. </li><li> Plaats poppen in het deksel van een droge 35 mm petrischaal. </li></ol> Opmerking: Wij over het algemeen hersenen gebruiken van poppen tussen 55-78 uur na puparium vorming (APF). Het is iets moeilijker te ontleden van de hersenen van de jongere poppen, omdat het hoofd capsules hebben de neiging in te storten, terwijl het algemene niveau van neurietuitgroei is iets lager uit de oudste poppen. In het kanton-S wildtype stam, worden deze stadia herkend door gepigmenteerde ogen die zijn licht bruin tot licht roodachtig, met weinig pigment elders. IV. Onthoofding in dissectiemicroscoop <ol><li> Plaats twee druppels steriele ontleden oplossing in het deksel van de petrischaal, naast de poppen. </li><li> Voorzichtig bezit zijn van een enkele pop met fijne tang in de linkerhand en gebruik een 27 gauge naald bevestigd aan een 1 cc spuit in de rechterhand om de cuticula te verwijderen aan het voorste einde van de pop. </li><li> Knijp een beetje pop met een pincet en het hoofd naar voren komt te gebruiken 27 gauge naald voor aan de hals verbreken. </li><li> Met de punt van de naald of de tang, transfer hoofd te laten vallen van het ontleden oplossing. </li><li> Herhaal dit tot je 10 tot 15 koppen in een enkele druppel. </li></ol> V. Het verwijderen van de hersenen van hoofd onder dissectiemicroscoop <ol><li> In elke hand bezit zijn van een 1 cc injectiespuit met een 27 gauge naald. </li><li> Gebruik deze om de vliegen kop positie in de daling van ontleden oplossing, zodat de snuit is naar u toe en het dorsale oppervlak van de kop is het noorden. </li><li> Steek de linkernaald in de proboscis aan het hoofd vast te pinnen en het recht naald te gebruiken om een ​​spleet te maken in het rechter oog, dat gaat van de ventrale naar het dorsale oppervlak. </li><li> Steek de rechternaald de buurt van de links in de regio van de proboscis en gebruik vervolgens de linker naald om de cuticula zachtjes drukken over het linker oog, waardoor de hersenen in de richting van de gleuf in het rechter oog. De hersenen moeten komen uit de gleuf aan de rechterkant, relatief intact, vaak met zowel optische lobes nog steeds vast en soms ook de gepigmenteerde oogweefsel ook. </li><li> Duw de hersenen op de achterkant van de naald en transfer naar een daling van de steriele zoutoplossing in het ontleden van een nieuwe steriele, 35 mm petrischaaltje. </li><li> Verzamel 10-15 hersenen voor elk genotype. </li></ol> VI. Verwijdering van optische lobben en enzym behandeling <ol><li> In elke hand bezit zijn van een 1 cc injectiespuit met een 27 gauge naald en deze gebruiken om alle breinen te verzamelen in een klein gebied van de druppel ontleden oplossing </li><li> Gebruik spuiten bijvoorbeeld snijgereedschap aan de optische kwabben te verwijderen uit elke hersenen, zodat het weefsel nog voor cultuur is het centrale hersengebied. </li><li> Gebruik een 20 ul Pipetman, vastgesteld op 5 pi, om alle de hersenen van een enkel genotype transfer naar een Eppendorf buisje met 1 ml van de steriele papaïne oplossing. </li><li> Hersenen geïncubeerd in papaïne voor 10-15 minuten op een rotator ingesteld op 60 rpm. </li><li> Centrifugeer bij 3000 rpm gedurende 3 minuten. </li></ol> Binnen steriele laminaire stroming capuchon - alle stappen waar weefsel wordt blootgesteld aan lucht moet worden gedaan in laminaire stroming kap voor de resterende stappen. VII. Het wassen <ol><li> Verwijder de enzym oplossing en te vervangen door steriele ontleden oplossing. </li><li> Centrifugeer bij 3000 rpm gedurende 3 minuten. </li><li> Wassen met steriele ontleden oplossing een totaal 3 keer. </li><li> Verwijder ontleden zout en te vervangen door DDM2. </li><li> Centrifuge en was een totaal van 2 keer met DDM2. </li><li> Overdracht hersenen en media om een ​​steriele 35 mm petrischaal. </li></ol> VIII. Aanwrijving en Plating onder dissectiemicroscoop <ol><li> Plaats 5 ul van DDM2 in het centrum van een dekglaasje aan. </li><li> Overdracht een hersenen om deze daling van DDM2 met een gele punt. </li><li> Onder de microscoop, gebruik van 27 gauge naalden te puntentotaal hersenen in kleine stukjes (moet &lt;1 minuut duren). </li><li> Onder visuele begeleiding, breek het uiteinde van een glazen pipet die is getrokken op een fijne punt, zodat de grotere stukken kan voorzichtig worden gezogen in de punt van de pipet en verdreven terug in het medium. We maken gebruik van mond zuig-buizen die worden standaard geleverd met 100 ul hematocriet capillaire glas. Let op: Zorg ervoor dat u bubbels te krijgen in de media en je moet empirisch bepalen wat de beste grootte pipet te gebruiken. Goeden kunt u naar de hersenen scheiden met een aantal individuele cellen en nog steeds enkele grote klompen, in ongeveer 30 seconden / hersenen. Wanneer je kijkt naar deze bij een hogere macht, moet ongeveer 10-20% van de neuronen hebben nog een aantal processen nog, en er zal nog een paar grote klonten. Als u te veel losmaken, vervolgens alle cellen zullen worden rond en zij zullen hebben geleden zoveel schade zullen ze niet overleven. Deze stap vraagt ​​oefening en moet snel worden gedaan, omdat er een grote oppervlakte-volume verhouding en de osmolaliteit en de pH van de daling van DDM2 kan snel veranderen. Weefsel moet worden geplaatst in CO 2 incubator zo snel mogelijk. </li><li> Schrijven op het petrischaaltje deksel: &quot;Genotype, datum en tijd&quot;. </li><li> Zet de 35 mm petrischaal in een 100 mm petrischaal (met natte kimwipe) en laat zich in de CO 2 incubator gedurende 30 minuten. </li><li> Overstroming van de 35 mm gerecht met 1,5 ml DDM2. </li><li> Houd culturen in de incubator bij 5% CO 2 incubator (23 ° C). Opmerking: Als u geen toegang hebt tot een afkoeling van CO 2 incubator, gebruik dan een standaard weefsel van zoogdieren cultuur incubator en of het in een koele ruimte en warmte tot 23 ° C, of zet in het lab, uit te schakelen temp en gebruik ijs in een lade aan de onderkant van de incubator op temp regelen rond ambient. </li></ol> IX. Feeding Cellen <ol><li> Op dag een (volgende dag), voeg 0,5 ml van CNBM/B27 (geconditioneerde media) om 03:01 DDM2 maken: CNBM/B27. </li><li> Op dag 5 vervangen door 1 ml van de media voor 03:01 DDM2: CNBM/B27. </li><li> Blijven voeden cellen met 3:01 DDM2: CNBM/B27 om de 4-5 dagen. Opmerking: Culturen kan worden geteeld zonder de niet-neuronale geconditioneerde media, maar de neuronen lijken een beetje meer kwetsbaar en zijn moeilijker voor gebruik in de elektrofysiologie experimenten. </li></ol>

<ol><li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Culturing+Nerve+Cells%22">Culturing Nerve Cells</a>. Banker, G., Goslin, K. , MIT Press. Cambridge. (1991).</li>
<li>Rohrbough, J., O'Dowd, D. K., Baines, R. A., Broadie, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+bases+of+behavioral+plasticity%3A+Establishing+and+Modifying+synaptic+circuits+in+the+Drosophila+Genetic+System%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Cellular bases of behavioral plasticity: Establishing and Modifying synaptic circuits in the Drosophila Genetic System.</a> J. Neurobiol. 54, 254-271 (2003).</li>
<li>O'Dowd, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Voltage-gated+currents+and+firing+properties+of+embryonic+Drosophila+neurons+grown+in+a+chemically+defined+medium%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Voltage-gated currents and firing properties of embryonic Drosophila neurons grown in a chemically defined medium.</a> J. Neurobiol. 27, 113-126 (1995).</li>
<li>Lee, D., O'Dowd, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+excitatory+synaptic+transmission+mediated+by+nAChR+in+cultured+Drosophila+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Fast excitatory synaptic transmission mediated by nAChR in cultured Drosophila neurons.</a> J. Neurosci. 19, 5311-5321 (1999).</li>
<li>Su, H., O'Dowd, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+synaptic+currents+in+Drosophila+mushroom+body+Kenyon+cells+are+mediated+by+alpha-bungarotoxin-sensitive+nAChRs+and+picrotoxin-sensitive+GABA+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Fast synaptic currents in Drosophila mushroom body Kenyon cells are mediated by alpha-bungarotoxin-sensitive nAChRs and picrotoxin-sensitive GABA receptors.</a> J. Neurosci. 23, 9246-9253 (2003).</li>
<li>Jiang, S. A., Campusano, J. M., Su, H., O'Dowd, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+mushroom+body+Kenyon+cells+generate+spontaneous+calcium+transients+mediated+by+PLTX-sensitive+calcium+channels%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Drosophila mushroom body Kenyon cells generate spontaneous calcium transients mediated by PLTX-sensitive calcium channels.</a> J. Neurophysiol. 94, 491-500 (2005).</li>
<li>Campusano, J. M., Su, H., Jiang, S. A., Sicaeros, B., O'Dowd, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((nAChR-mediated+calcium+responses+and+plasticity+in+Drosophila+Kenyon+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Develop+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">nAChR-mediated calcium responses and plasticity in Drosophila Kenyon cells.</a> Develop Neurobiol. 67, 1520-1532 (2007).</li>
<li>Oh, H. -W., Campusano, J. M., Hilgenberg, L. G. W., Sun, X., Smith, M. A., O'Dowd, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrastructural+analysis+of+chemical+synapses+and+gap+junctions+between+Drosophila+brain+neurons+in+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Develop+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Ultrastructural analysis of chemical synapses and gap junctions between Drosophila brain neurons in culture.</a> Develop Neurobiol. , (2007).</li>
</ol>

Neuronen geoogst uit de hersenen van het embryo / de postnatale knaagdieren kunnen worden gekweekt in de primaire cel cultuur waar ze uit te breiden neurieten en vormen functionele synaptische verbindingen. Methoden voor de voorbereiding van deze culturen zijn goed ingeburgerd en studies in knaagdieren neuronale culturen hebben een cruciale rol gespeeld bij het identificeren van genen en omgevingsfactoren betrokken zijn bij de regulering van synapsvorming en functie (Banker en Goslin, 1991). Terwijl insect neuronen uit een verscheidenheid v...

Coating Dekglaasjes: Zet geautoclaveerd dekglaasjes in een 60 mm petrischaal. Pipetteer 5 ul van Con A / Laminine mix op midden van elk dekglaasje aan. Plaats in 37 C incubator gedurende 2 uur. Spoel 3x coverslips met 100 ul van geautoclaveerd water per stuk. Gebruik stofzuiger bevestigd aan een steriele Pasteur pipet. Tijdens de laatste spoeling, pak het dekglaasje met een tang en droog beide kanten. Breng het dekglaasje met een 35mm petrischaal. Bewaren bij kamertemperatuur tot maximaal een maand.

primaire neuronale culturen uit de hersenen van laat stadium drosophila poppen

Primary Neuronal Cultures from the Brains of Late Stage Drosophila Pupae

In deze video, tonen we de voorbereiding van de primaire neuronale culturen uit de hersenen van laat stadium Drosophila poppen. De procedure begint met het verwijderen van hersenen van dieren op 70-78 uur na puparium vorming. De geïsoleerde hersenen worden weergegeven na een korte incubatie in papaïne gevolgd door verschillende wasbeurten in serum-vrij groeimedium. Het proces van mechanische dissociatie van elk brein in een 5 ul druppel van media op een dekglaasje wordt geïllustreerd. De axonen en dendrieten van de post-mitotische neuronen zijn sheered uit de buurt van de soma tijdens dissociatie, maar de neuronen beginnen te regenereren processen binnen een paar uur in de platen. Beelden tonen levende culturen op 2 dagen. Neuronen blijven om processen te werken tijdens de eerste week in de cultuur. Specifieke neuronale populaties kunnen worden geïdentificeerd met behulp van cultuur GAL4 lijnen om weefselspecifieke expressie van fluorescente merkers zoals GFP of RFP rijden. Hele cel opnames hebben aangetoond dat de gekweekte neuronen vorm functionele, spontaan actief cholinerge en GABA-erge synapsen. Een korte video-segment illustreert calcium dynamiek in de gekweekte neuronen met behulp van Fura-2 als een calcium indicator kleurstof tot spontane calcium transiënten en nicotine opgewekt calcium reacties in een schotel van gekweekte neuronen te controleren. Deze pop-hersenen culturen zijn een bruikbaar model systeem waarin genetische en farmacologische middelen kunnen worden gebruikt om intrinsieke en extrinsieke factoren die de vorming en de functie van centrale synapsen beïnvloeden te identificeren.

Deze video toont de bereiding van primaire neuronale culturen uit de hersenen van laat stadium Drosophila poppen. Standpunten van levende culturen tonen neurietuitgroei en beeldvorming van calcium niveaus met behulp van Fura-2.

Primaire neuronale culturen uit de hersenen van laat stadium Drosophila Poppen

In deze video demonstreren we de preparatie van primaire neuronale culturen uit de hersenen van Drosophila-poppen in een laat stadium. De procedure begint met de ...

Mijn naam is Diana Dowd en ik ben professor bij de afdelingen Anatomie en Neurobiologie en Ontwikkelings- en Celbiologie hier aan uc Irvine. Vandaag ga ik u vertellen over de preparatie van neuronale culturen uit Drosophila-poppen. Dit omvat het verwijderen van de hersenen uit poppen in een laat stadium, waarbij we doorgaans alleen de centrale hersenregio kweken.In dit stadium zijn de belangrijkste anatomische structuren die in het volwassen brein aanwezig zijn, al gevormd. Dit omvat de antennelobben, waarin projectieneuronen zich bevinden die hun axonen helemaal naar de regio van het paddenstoellichaam sturen, en de neuronen van het paddenstoellichaam, de Kenyon-cellen, die hun axonen via de alfa-, bèta- en gammalobben naar hun doelneuronen hebben gestuurd. Op de dag van het kweken is het eerste wat we doen het betreden van de laminaire flowkast, waar we steriel de enzymoplossing voorbereiden die we zullen gebruiken om het weefsel te dissociëren.Daarnaast bereiden we het medium voor dat we zullen gebruiken voor het kweken van de cellen. Dit wordt gemaakt van stocks die we vooraf hebben klaargezet. De volgende stap is het verzamelen van de pupae die we zullen gebruiken voor deze di

primary-neuronal-cultures-from-brains-late-stage-drosophila

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Deze video toont de bereiding van primaire neuronale culturen uit midgastrula podium Drosophila embryo's. Standpunten van levende culturen tonen cellen 1 uur na de beplating en gedifferentieerde neuronen na 2 dagen van groei in een bicarbonaat-based gedefinieerd medium. De neuronen zijn elektrisch prikkelbaar en vormen synaptische verbindingen.

De voorbereiding van Neuronale Culturen van Midgastrula Stage Drosophila embryo&#39;s

Wij bieden een gedetailleerd protocol voor het bereiden van primaire cellen los...

Primaire celculturen van Drosophila Gastrula Embryo&#39;s

Dit artikel beschrijft een werkwijze waarbij men kunnen...

Ex vivo kweken van Whole, Het ontwikkelen van Drosophila Brains

This video demonstrates a protocol to identify exogenous factors that initiate the reactivation of Drosophila brain neural stem cells from their quiescent state. Freshly hatched larvae are dissected to isolate their brains, which are then cultured in media with or without a test hormone to evaluate the hormone's potential to induce neural stem cell reactivation and proliferation.

Analyzing Neural Stem Cell Reactivation in Cultured Drosophila Brain Explants

Een blessure paradigma met behulp van de Drosophila larven ventrale zenuw koord aan het centrale zenuwstelsel regeneratie en reparatie te onderzoeken wordt beschreven. Stekende gevolgd door laser scanning confocale microscopie in time-lapse en vaste monsters, gecombineerd met kwantitatieve analyse met doelgericht ontwikkelde software en genetica, worden gebruikt om de moleculaire mechanismen van CNS regeneratie en reparatie onderzoeken.

Een blessure Paradigm aan het centrale zenuwstelsel Reparatie Onderzoek in<em&gt; Drosophila</em

Drosophila S2 cellen en gekweekte neuronen zijn zeer geschikt voor beeldvorming van motor aangedreven organel transport in vivo. Hier beschrijven we gedetailleerde protocollen voor het kweken van beide celtypen, hun beeldvorming en analyse van het vervoer.

Organel Transport in gekweekte Drosophila Cellen: S2 cellijn en primaire neuronen.

Immuunkleuring is een effectieve techniek voor het visualiseren van specifieke celtypen en eiwitten in weefsels. Door het gebruik van sonicatie vermindert het hier beschreven protocol de noodzaak om Drosophila melanogaster weefsels van laat-stadium embryo's en larven te dissekeren voordat immunokleuring wordt uitgevoerd. We bieden een efficiënte methodologie voor de immunokleuring van formaldehyde-gefixeerde hele larven.

-Sonicatie vergemakkelijkt immunofluorescentiekleuring van Late-fase embryonale en larvale<em&gt; Drosophila</em&gt; Weefsels<em&gt; In Situ</em

Dit protocol Gegevens een gestroomlijnde methode voor live cell imaging uitvoeren in het kader van een intact larvale hersenen. Live cell imaging benaderingen zijn van onschatbare waarde voor de studie van asymmetrische neurale stamcellen divisies evenals andere neurogene en ontwikkelingsprocessen, consequent blootleggen van mechanismen die eerder over het hoofd gezien.

Live-Imaging van<em&gt; Drosophila</em&gt; Larvale neuroblasts

Dit protocol beschrijft de dissectie en immunokleuring van volwassen Drosophila melanogaster brain weefsels. Dit protocol benadrukt in het bijzonder het gebruik van Drosophila paddestoel lichaam en fotoreceptor neuronen als voorbeeld neuronale subsets kunt weergeven die nauwkeurig kunnen worden gebruikt voor het ontdekken van de algemene beginselen die ten grondslag liggen aan vele aspecten van neuronale ontwikkeling.

Dissectie en immunefluorescentie kleuring van Mushroom lichaam en fotoreceptor neuronen in de hersenen van de volwassen Drosophila melanogaster

Dit artikel biedt gedetailleerde protocollen voor het toebrengen van penetrerend traumatisch hersenletsel (PTBI) aan volwassen Drosophila en het onderzoeken van de resulterende neurogenese.

Stimuleren en analyseren van volwassen neurogenese in de drosophila centrale hersenen

Er is een methode vastgesteld om rustige neurale stamcellen in gekweekte Drosophila-hersenexplantaten te reactiveren. Met behulp van deze methode kan de rol van systemische signalen worden losgekoppeld van weefselintrinsieke signalen in de regulatie van neurale stamcelrust, in- en uitgang.

Neurale stamcelreactivatie in gekweekte Drosophila-hersenexplantaten

Leer primaire neuronale culturen bereiden uit de hersenen van laat stadium Drosophila poppen. Deze methode toont neurietuitgroei en calciumbeeldvorming met Fura-2 voor onderzoek naar neuronale ontwikkeling en activiteit.

Primaire neuronale culturen uit de hersenen van laat stadium Drosophila Poppen

Meer video's verkennen