Name: Cultivos neuronales primarios del cerebro de Drosophila pupas etapa tardía (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-05-28T00:00:00.000+00:00
Duration: 15 min 12 s
Description: Aprende a preparar cultivos neuronales primarios del cerebro de pupas tardías de Drosophila. Este método permite estudiar el desarrollo neuronal y la dinámica del calcio en neuronas cultivadas.

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Este trabajo fue apoyado por el NIH subvención NS27501 a DKOD. El apoyo adicional para este trabajo fue proporcionado por una beca de la Universidad de California Irvine en apoyo de DKOD a través del Programa profesor del HHMI.

Los preparativos antes del día de cultivo: <ol><li> Hacer una solución estéril de disección. </li><li> Hacer estéril DMEM y mantenerse en alícuotas de 10 ml a 4 º C durante 2 semanas. </li><li> Hacer estéril DDM2 suplementos y congelar en 50 o 100 alícuotas de 1 mes. </li><li> Hacer ConA / laminina. </li><li> Cubreobjetos de abrigo. Opcional: Haga CNBM estéril y guardar congelado hasta por 4 meses. </li></ol> En el día de cultivo I. Preparar la solución de la enzima (ES) en la campana de flujo laminar <ol><li> Poner 5 ml de solución de disección (DS) en un tubo de centrífuga de 15 ml. </li><li> Pesar 0,8 mg de L-cisteína en un eppendorf de 0,6 ml y añadir 150 ml de DS. Pipeta hacia arriba y abajo hasta que los cristales se han ido. </li><li> Añadir 150 ml de DS / cisteína al 5 DS ml y mezclar bien. </li><li> Añadir 50 U (unidades) de la papaína. </li><li> 7 ml de 0,1 N de Na OH y mezclar bien. Solución clara a los 30 minutos. cuando se activa. </li><li> Solución de la enzima de filtro con filtro de 0,2 mm en una jeringa estéril de 1,5 ml tubo de microcentrífuga tapa rosca Papaína: ¿Quieres 50 U en 5 ml DS. Cada lote es un poco diferente, por lo que debe calcular la cantidad de: 37,3 mg / ml y 28,3 U / mg 37,3 x 28,3 = 1055,59 U / ml (1000 ml) 50 U = 47,4 ml </li></ol> II. Hacer DDM2 medios En el día de cultivo: añadir los siguientes complementos para hacer DDM2 A 10 ml de DMEM añadir los suplementos, justo antes de cultivo: <ol><li> 100μl de transferrina </li><li> 100μl putrescina </li><li> 100μl selenio </li><li> La progesterona 100μl </li><li> La insulina 50μl </li><li> 10μl de 20 Hydroxyecdysone </li></ol> Nota: Asegúrese DDM2 suficiente para todas las culturas planificadas (cada cerebro colocadas en un portaobjetos simple en un individuo de 35 mm placa de Petri, 1,5 m de los medios de comunicación / cultura) Paso III-VI puede estar en una mesa de laboratorio hecho estéril y debe ser completado en 45 minutos o menos. III. Pupas Colección <ol><li> Seleccione 10-15 pupas de los lados del vial con un microscopio de disección. </li><li> Lugar pupas en la tapa de una seca de 35 mm placa de Petri. </li></ol> Nota: Por lo general, utilizan los cerebros de las pupas entre 55-78 horas después de la formación de pupa (APF). Es un poco más difícil de diseccionar el cerebro de las pupas jóvenes ya que las cápsulas cefálicas y tienden a colapsarse, mientras que el nivel general de crecimiento de las neuritas es ligeramente más baja desde el más antiguo pupas. En la cepa de tipo salvaje Cantón-S, estas etapas son reconocidos por los ojos pigmentados que son de color marrón claro a rojizo poco, con poco pigmento en otros lugares. IV. Decapitación bajo microscopio de disección <ol><li> Coloque dos gotas de solución estéril de disección en la tapa de la placa de Petri, junto a las pupas. </li><li> Aplique suavemente una sola pupa con unas pinzas finas en la mano izquierda y el uso de una aguja de calibre 27 jeringa conectada a una jeringa de 1 cc en la mano derecha para eliminar la cutícula en el extremo anterior de la pupa. </li><li> Apriete pupa poco con pinzas, y como cabeza emerge uso aguja de calibre 27 para cortar el cuello. </li><li> Con la punta de la aguja o con pinzas, la transferencia de la cabeza a la caída de la disección de una solución. </li><li> Repita hasta que haya 10-15 cabezas en una sola gota. </li></ol> V. Eliminación del cerebro de la cabeza bajo el microscopio de disección <ol><li> En cada mano, mantener una jeringa de 1 cc con una aguja de calibre 27. </li><li> Utilice estos a la posición de la cabeza de mosca en la caída de la disección de una solución para la probóscide es hacia arriba y la superficie dorsal de la cabeza es el norte. </li><li> Inserte la aguja a la izquierda en la trompa de echar la cabeza hacia abajo y el uso de la aguja derecha para hacer una raja en el ojo derecho, que va desde el ventral a la superficie dorsal. </li><li> Insertar la aguja justo al lado de la izquierda en la región de la trompa y luego usar la aguja izquierda para presionar suavemente la cutícula sobre el ojo izquierdo, empujando el cerebro hacia el corte en el ojo derecho. El cerebro debe surgir de la ranura de la derecha, relativamente intacto, a menudo con ambos he ópticabes aún está unido y en ocasiones el tejido ocular pigmentado así. </li><li> Empuje el cerebro en la parte posterior de la aguja y la transferencia de una gota de solución salina estéril de disección en un nuevo plato de estériles de 35 mm de Petri. </li><li> Recoger 10-15 cerebro para cada genotipo. </li></ol> VI. Eliminación de los lóbulos ópticos y tratamiento enzimático <ol><li> En cada mano, mantener una jeringa de 1 cc con una aguja de calibre 27 y usarlas para recopilar todos los cerebros en una pequeña área de la gota de la solución de disección </li><li> Use jeringas, herramientas de corte para eliminar los lóbulos ópticos de cada cerebro para el resto del tejido de la cultura es la región del cerebro. </li><li> Use un Pipetman 20 l, del 5 l, para transferir todos los cerebros de un solo genotipo a un tubo eppendorf con 1 ml de solución de papaína estéril. </li><li> Los cerebros se incubaron en la papaína durante 10-15 minutos en un conjunto rotatorio a 60 rpm. </li><li> Centrifugar a 3000 rpm durante 3 minutos. </li></ol> Dentro de campana estéril de flujo laminar - todas las medidas que el tejido es expuesto al aire se debe hacer en campana de flujo laminar para el resto de pasos. VII. Lavado <ol><li> Eliminar la solución de la enzima y reemplazar con una solución estéril de disección. </li><li> Centrifugar a 3000 rpm durante 3 minutos. </li><li> Lavar con una solución estéril de la disección de un total de 3 veces. </li><li> Quitar y reemplazar la disección de solución salina con DDM2. </li><li> Centrifugar y lavar con un total de 2 veces con DDM2. </li><li> La transferencia de los cerebros y los medios de comunicación a una estéril de 35 mm placa de Petri. </li></ol> VIII. Trituración y de las planchas bajo microscopio de disección <ol><li> Lugar 5 ul de DDM2 en el centro de un cubreobjetos. </li><li> La transferencia de un cerebro a esta caída de DDM2 con una punta amarilla. </li><li> Bajo el microscopio, el uso de agujas de calibre 27 dados hasta el cerebro en pedazos pequeños (se debe tomar &lt;1 minuto). </li><li> Bajo la guía visual, rompa la punta de una pipeta de vidrio que ha sido puesto a un punto fino para que las piezas más grandes pueden ser absorbidos por el cuidado extremo de la pipeta y expulsados ​​de nuevo en el medio. Usamos tubos de boca de succión que vienen de serie con 100 l de vidrio de hematocrito capilar. Nota: Tenga cuidado de no tener burbujas en los medios de comunicación y que tendrá que determinar empíricamente la pipeta de mejor tamaño para su uso. Los buenos le permiten disociar el cerebro con algunas células individuales y aún así algunos grandes grupos, en unos 30 segundos / cerebro. Cuando se mira a estos a una potencia mayor, aproximadamente el 10-20% de las neuronas todavía debe tener algunos procesos pendientes y todavía habrá algunos grandes grupos. Si se disocian demasiado, entonces todas las células se ronda y ellos han sufrido tanto daño que no va a sobrevivir. Este paso requiere práctica y debe hacerse rápidamente, ya que hay una gran superficie-a-volumen y la osmolalidad y el pH de la caída de DDM2 pueden cambiar rápidamente. Tejido tiene que ser colocado en incubadora de CO 2 tan pronto como sea posible. </li><li> Escribir en la tapa de la placa de Petri: &quot;genotipo, fecha y hora&quot;. </li><li> Coloque la placa de Petri de 35 mm en una placa de Petri de 100 mm (con Kimwipe húmedo) y dejar reposar en la incubadora de CO 2 durante 30 minutos. </li><li> Inundar el plato de 35 mm con 1,5 ml de DDM2. </li><li> Mantenga las culturas en la incubadora en un 5% incubadora de CO 2 (23 ° C). Nota: Si usted no tiene acceso a un enfriamiento incubadora de CO 2, utilizar un estándar de cultivo de tejidos de mamíferos incubadora y, o bien ponerlo en un cuarto frío y el calor a 23 ° C, o poner en el laboratorio, cierre temporal, y el uso de hielo en una bandeja en la parte inferior de la incubadora para regular temperatura ambiente alrededor. </li></ol> IX. Las células de alimentación <ol><li> El día 1 (día siguiente), añadir 0,5 ml de CNBM/B27 (Media acondicionado) para hacer DDM2 03:01: CNBM/B27. </li><li> El día 5 reemplazar 1 ml de los medios de 3:01 DDM2: CNBM/B27. </li><li> Mantener las células de alimentación con 3:01 DDM2: CNBM/B27 cada 4-5 días. Nota: Los cultivos pueden crecer sin los medios de comunicación acondicionado no neuronales, pero las neuronas parecen un poco más frágil y son más difíciles para su uso en experimentos de electrofisiología. </li></ol>

<ol><li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Culturing+Nerve+Cells%22">Culturing Nerve Cells</a>. Banker, G., Goslin, K. , MIT Press. Cambridge. (1991).</li>
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</ol>

Las neuronas cosecha de los cerebros de los roedores embrionarias / postnatal se puede cultivar en cultivo de células primarias, donde se extienden neuritas y la forma funcional de conexiones sinápticas. Métodos para la preparación de estas culturas están bien establecidos y los estudios en cultivos de neuronas de roedores han jugado un papel fundamental en la identificación de genes y factores ambientales implicados en la regulación de la formación de sinapsis y la función (Banker y Goslin, 1991). Mientras que las neuronas de insectos de u...

Cubreobjetos de recubrimiento: Ponga en un autoclave cubreobjetos de 60 mm placa de Petri. Pipeta de 5 ul de Con una mezcla / laminina en el centro de cada cubreobjetos. Lugar en 37 ° C incubadora durante 2 horas. Enjuague cubreobjetos 3x con 100 ul de agua esterilizada cada uno. El uso de vacío conectada a una pipeta Pasteur estéril. Durante el último enjuague, levante el cubreobjetos con unas pinzas y seque ambos lados. Transferir el portaobjetos a una placa de Petri de 35 mm. Conservar a temperatura ambiente durante un máximo de un mes.

cultivos neuronales primarios del cerebro de drosophila pupas etapa tardía

Primary Neuronal Cultures from the Brains of Late Stage Drosophila Pupae

En este vídeo, se demuestra la preparación de cultivos primarios de neuronas del cerebro de Drosophila finales de etapa de pupas. El procedimiento comienza con la eliminación de los cerebros de los animales en 70-78 horas después de la formación pupario. Los cerebros aislados se presentan después de la incubación breve en papaína seguido de varios lavados en medio de cultivo libre de suero. El proceso de separación mecánica de cada cerebro en una caída de 5 ul de los medios de comunicación en un cubreobjetos se ilustra. Los axones y las dendritas de las neuronas post-mitóticas son sheered cuando esté cerca del soma en la disociación, pero las neuronas comienzan a regenerarse los procesos dentro de unas horas de la siembra. Las imágenes muestran las culturas en vivo en 2 días. Las neuronas continúan elaborando los procesos durante la primera semana de la cultura. Poblaciones neuronales específicas, se pueden identificar en la cultura de uso de líneas GAL4 para dirigir la expresión específica de tejido de los marcadores fluorescentes, como las buenas prácticas agrarias o RFP. Grabaciones de células enteras han demostrado los cultivos de neuronas forman sinapsis funcionales, colinérgicas y GABAérgicas espontáneamente activo. Un segmento corto video ilustra la dinámica del calcio en las neuronas cultivadas con Fura-2 como un tinte indicador de calcio para controlar los transitorios espontánea de calcio y la nicotina respuestas evocadas de calcio en un plato de neuronas cultivadas. Estas culturas el cerebro de pupa son un modelo útil en el que las herramientas genéticas y farmacológicas se puede utilizar para identificar los factores intrínsecos y extrínsecos que influyen en la formación y función de las sinapsis centrales.

Este video muestra la preparación de cultivos primarios de neuronas del cerebro de Drosophila pupas etapa tardía. Puntos de vista de las culturas show en vivo de crecimiento de las neuritas y la imagen de los niveles de calcio con Fura-2.

Cultivos neuronales primarios del cerebro de Drosophila pupas etapa tardía

En este video, demostramos la preparación de cultivos neuronales primarios a partir de los cerebros de pupas de Drosophila en estadio avanzado. El procedimiento comienza con la...

Me llamo Diana Dowd y soy profesora en los departamentos de Anatomía y Neurobiología, y Biología del Desarrollo y Celular aquí en la UC Irvine. Hoy les hablaré sobre la preparación de cultivos neuronales a partir de pupas de Drosophila. Este procedimiento implica la extracción del cerebro de pupas en estadios tardíos, y generalmente cultivamos únicamente la región del cerebro central.Y en esta etapa, las principales estructuras anatómicas presentes en el cerebro adulto ya están formadas. Esto incluye los lóbulos antenales, donde existen neuronas de proyección que envían sus axones hasta la región del cuerpo de la seta, y las neuronas del cuerpo de la seta, las células de Kenyon, que han enviado sus axones hacia sus neuronas diana a través de los lóbulos alfa, beta y gamma. El día del cultivo, lo primero que hacemos es entrar en la cabina de flujo laminar y preparar de forma estéril la solución enzimática que utilizaremos para disociar el tejido.También preparamos el medio que vamos a utilizar para cultivar las células. Este medio se elabora a partir de tallos que hemos preparado con anterioridad. El siguiente paso consiste en recolectar las pupas que vamos a usar para esta disociac

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Investigación

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Biología

Este video muestra la preparación de cultivos primarios de neuronas de midgastrula etapa embriones de Drosophila. Puntos de vista de las culturas show en vivo de las células de una hora después de la siembra y las neuronas diferenciadas después de 2 días de crecimiento en un medio de bicarbonato definido. Las neuronas son eléctricamente excitables y forman conexiones sinápticas.

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