דרוזופילה כימות צומת נוירומוסקולרי (NMJ): שיטה להערכת מורפולוגיה ותפקוד סינפטיים

- ראשית, זחלי דרוזופילה אימונוסטיים עם סמנים המדגישים היבטים שונים של NMJs או צמתים עצביים-שריריים. זהו האזור שבו סופו של אקסון נוירון מוטורי בא במגע עם שריר, והמורפולוגיה שלו משמשת כקריאה של תפקוד סינפטי.

האקסון מסתיים במספר ענפים היוצרים בליטות הנקראות בוטונים. מוליכים עצביים משתחררים מהבוטונים וגורמים להתכווצות שרירים. אזורים של שחרור נוירוטרנסמיטר נקראים אזורים פעילים. כאן סמן אחד הוא ספציפי עבור חלבון סינפטי המתאר את NMJ, והסמן השני הוא עבור חלבון הנמצא באזורים פעילים.

לאחר מכן, רכשו תמונות NMJ באמצעות מיקרוסקופיה והעריכו כמותית את המורפולוגיה שלהן באמצעות תוכנת ניתוח תמונות חצי אוטומטית. החילו סדרה מוגדרת מראש של פקודות תוכנה על התמונות. קובצי הפלט מכילים תמונות NMJ מנותחות ותוצאות מורפולוגיה. התכונות שניתן למדוד כוללות מספר ושטח פנים של בוטונים, אורך NMJ ומספר ענף, מספר תאי NMJ לא מחוברים ומספר האזורים הפעילים.

בדוגמה הבאה ננתח את המורפולוגיה של NMJ דרוזופילה המוכתמת ב-DLG1, סמן פוסט-סינפטי, וב-BRP, סמן אזור פעיל.

- עבור פרוטוקול זה, צור ערימות תמונות של NMJs ושמור אותם כקבצי TIFF בודדים כאשר ערוץ 1 מציג צביעת DLG1 או סמן דומה וערוץ 2 מציג צביעת BRP. כדי להתחיל, צור הקרנות Z וערימות יתר של קובצי התמונה של NMJ. פתח את אפשרויות התוסף ובחר Drosophila NMJ morphometrics.

כעת, זהה את מחרוזת הקבצים הייחודית שהמיקרוסקופ הקצה לסדרת התמונות בעת אחסונן כ- TIFF. זה יהיה בסוף שם התמונה. העתק והדבק את המחרוזת הנתונה למספר המישור והערוץ הנמוך ביותר בחלון הגדרת מחרוזת הקבצים הייחודי. לאחר מכן בחר את מאקרו המשנה 'המר לערימה' ובחר את הספרייה או התיקיה שבה התמונות ממוקמות.

לכל קובץ תמונה, נוצרים שני קבצים חדשים עם אוסף השמות והאוסף השטוח של ברירת המחדל, ולאחר מכן שם התמונה המקורי. לאחר מכן ניתן למחוק את הקבצים המקוריים כדי לחסוך מקום אחסון. לאחר מכן, מתוך ממשק Drosophila NMJ morphometrics, בחר את תת המאקרו ROI מוגדר ובחר את ספריית קובץ התמונה.

עם פתיחת ההקרנה הראשונה, בחרו בכלי בחירות חופשיות ולאחר מכן השתמשו בעכבר כדי להגדיר אזור הכולל מסוף NMJ שלם של עניין. לאחר שנבחר, לחץ על אישור בחלון המסוף המוגדר. המשך לעשות זאת עד שמסופי NMJ יוגדרו בכל התחזיות. המאקרו מקדם את התהליך באופן אוטומטי. עבור כל קובץ תמונה, נוצר קובץ חדש אחד עם החזר ההשקעה של שמות ברירת המחדל ואחריו שם התמונה המקורי.

כדי לכמת את תכונות NMJ, תחילה עבור אל ממשק Drosophila NMJ morphometrics והגדר את קנה המידה. לדוגמה, אם פיקסל אחד בתמונה מתאים ל- 0.72 מיקרון, הגדר את גודל הפיקסלים ל- 1 ואת מרחק קנה המידה ל- 0.072. לאחר מכן בחר את תת-המאקרו נתח, ואם יש שתי תמונות ערוצים, העבר גם את החלף המתנה. לחץ על OK וכאשר תתבקש לעשות זאת, בחר את ספריית קובצי התמונה. זמן העיבוד יכול להיות מספר דקות לכל סינפסה.

לאחר הניתוח, קובצי תמונה חדשים לכל סינפסה מנותחת מאוחסנים בתיקיית ההורים, והמדידות הכמותיות נמצאות בקובץ results.txt. בדוק את כל התמונות ולא כלל תמונות עם שגיאות סגמנטציה.

לדוגמה, ייתכן שחלקים מהמסוף הסינפטי לא ייכללו בחלוקה לרמות הצהובה. חלקים מהרקע עשויים להיכלל במסוף הסינפטי. קו שלד כחול עשוי להימשך מעבר למסוף הסינפטי. ייתכן שיש יותר מדי אזורים פעילים, או שאזורים פעילים מסוימים עשויים להישאר בלתי מזוהים.