Dissociação mecânica: um método para obter células viáveis de um tecido

Primeiro, pese um fragmento de tecido e meça seu comprimento, largura e altura. Coloque o tecido em uma placa de cultura com meio de cultura e corte-o em pedaços pequenos usando um bisturi. Transfira tudo para um tubo C para homogeneização usando uma pipeta Pasteur.

Coloque o tubo em um dissociador mecânico e execute os ciclos conforme necessário. O aparelho usa forças mecânicas para extrair células individuais viáveis da amostra de tecido, mantendo a integridade celular, incluindo as proteínas de superfície. Decantar o homogeneizado através de um filtro de células fixado num tubo de centrifugação.

Homogeneizar novamente o tecido restante e coar o homogeneizado através do filtro de células para dentro do tubo. Centrifugar o homogenato e remover o sobrenadante. Agora, ressuspenda o pellet celular no meio de cultura e transfira uma pequena quantidade da suspensão celular para um tubo contendo a coloração azul de tripano.

Após a coloração, transfira as células para uma lâmina de hemocitômetro. Conte as células viáveis transparentes. As células mortas absorvem a mancha, pois sua membrana celular não está intacta. No protocolo a seguir, realizaremos dissociação não enzimática de tecido humano fresco para análise quantitativa e qualitativa de células CD45+.

- Comece pesando a amostra de tecido e, em seguida, medindo o comprimento, a largura e a altura do tecido. Em seguida, transfira o fragmento de tecido para uma pequena placa de Petri contendo 1 mililitro do meio de células hematopoiéticas quimicamente definido e sem soro apropriado e use um bisturi estéril para cortar as amostras em pequenos pedaços de 1 a 2 milímetros quadrados. Em seguida, transfira o conteúdo do prato para um tubo C dissociador mecânico e lave o prato e o bisturi com 2 mililitros de meio.

Adicione a lavagem ao tubo C e, em seguida, execute o programa dissociador mecânico 8.01 duas vezes sucessivas para homogeneizar suavemente os fragmentos de tecido em uma única suspensão celular. Após o segundo ciclo, decantar o homogeneizado através de um filtro de células de 40 micrómetros para um tubo cónico de 50 mililitros. Em seguida, use a mesma pipeta Pasteur da lavagem da placa de Petri para transferir qualquer líquido restante no tubo C para o filtro de células.

Em seguida, use uma micropipeta de 1 mililitro para transferir o líquido filtrado para um tubo cônico de 15 mililitros e enxágue o tubo C com mais 3 mililitros de meio. Transfira esta lavagem através do filtro de células para o tubo de 50 mililitros. Em seguida, mova suavemente o tecido não homogeneizado ao redor do filtro com uma ponta limpa de 1 mililitro para espremer a quantidade máxima de líquido residual preso no tecido no tubo de 50 mililitros. Agora coloque o filtro de células de cabeça para baixo em cima do tubo C original e enxágue o filtro com mais 3 mililitros de meio para que o tecido não homogeneizado caia de volta no tubo C.

Homogeneizar novamente o tecido por mais dois ciclos, como acabamos de demonstrar, e então despeje o segundo homogeneizado através do filtro de células novamente. Enxágue o tubo C com mais 3 mililitros de meio. Em seguida, filtre o sobrenadante através do filtro e esprema o líquido residual para fora do tecido, como acabamos de demonstrar. Neste ponto, um volume de aproximadamente 2,5 mililitros de suspensão unicelular deve estar presente no tubo de 15 mililitros e aproximadamente 9 mililitros devem ser observados no tubo de 50 mililitros.

Para separar o sobrenadante tecidual das células, centrifugar primeiro os dois tubos de homogenato durante 15 minutos a 600 Gs à temperatura ambiente. Transvase o sobrenadante do tubo de 15 mililitros para um tubo de 1,5 mililitro, colocando-o a 4 graus Celsius, e descarte o sobrenadante do tubo de 50 mililitros. Em seguida, bata suavemente em cada tubo em uma superfície dura para quebrar cada uma das pelotas celulares.

Ressuspendeu o pellet de células soltas no tubo de 50 mililitros com 500 microlitros de meio e transfira as células para o tubo de 15 mililitros para ressuspender o segundo pellet. Em seguida, enxágue o tubo de 50 mililitros com mais 500 microlitros de meio e transfira a lavagem para o tubo de 15 mililitros para máxima recuperação celular. Depois de contar o número de células viáveis por exclusão de azul de tripano, esfole a suspensão celular.

Finalmente, diminua o sobrenadante do tecido reservado. Em seguida, transfira cuidadosamente o sobrenadante para pelo menos um tubo limpo sem tocar ou perturbar o pellet e armazene-o a 80 graus Celsius negativos para análise futura a jusante.