Adenovirus-vermittelte genetische Entfernung von Signalmolekülen in kultivierten primären embryonalen Maus-Fibroblasten

Die moderne Genanalyse stützt sich stark auf Techniken, die es ermöglichen, bestimmte Gene gezielt aus Zellen, Organen oder ganzen Organismen zu entfernen. Diese Knockout-Experimente helfen, die Funktion des Gens in seinem zellulären Kontext aufzudecken. Die molekularmorphologischen und physiologischen Phänotypen des Knockouts geben Hinweise auf die Rolle der Genprodukte, die von der deletierten Sequenz kodiert werden.

In Modellorganismen wie Mäusen besteht eine gängige Methode zum Erreichen einer bedingten Gendeletion darin, das interessierende Gen oder Exon mit P-Stellen zu flankieren, die als Erkennungssequenzen für das Cree-Rekombinase-Enzym dienen. Die irreversible Exzision des sogenannten beflockten Allels wird dann von Cree katalysiert, wodurch die Sequenz aus dem Genom eliminiert wird. Es gibt verschiedene Methoden, um Cree-Rekombinase in das System einzuführen, darunter solche, die in vivo durchgeführt werden, und solche, die sich direkt mit etablierten Zellen befassen.

Für diese spezielle Anwendung werden wir ein Adenovirus verwenden, um Cree an Fibroblastenzellen zu liefern, die aus einer transgenen Maus mit einem Flockallel isoliert und kultiviert wurden. Diese Methode führt zu einer nahezu 100%igen Effizienz der transgenen Verabreichung. Wenn das Virus den Zellen verabreicht wird, wird es in einem endozytären Vesikel internalisiert und zur Kernhülle transportiert, wo seine DNA, einschließlich des interessierenden Transgens, durch den armen Komplex in den Zellkern eindringen kann.

Die zelluläre Maschinerie kann dann das injizierte Gen transkribieren und seine Proteinprodukte auf die Zelle einwirken lassen. In diesem Fall schneidet das viral kodierte Cree-Rekombinase-Enzym das beflockte Allel aus dem Genom der Wirtszelle heraus. Wir sind vom Jones Lab an der University of Guelph in Guelph, Ontario, Kanada.

In unserem Labor interessieren wir uns für das Konzept der Signaltransduktion und was passiert, wenn man bestimmte Komponenten verschiedener Signaltransduktionskaskaden entfernt. Heute werden wir uns eine Kaskade im Zusammenhang mit der Aktinorganisation ansehen. Die Signaltransduktion wird durch eine Reihe biochemischer Komponenten erreicht, die Informationen übertragen und phänotypische Veränderungen wie die Reorganisation von Aktinen hervorrufen.

Unser Protein von Interesse ist RAC one, ein kleines gtpa, das für die Vermittlung der Aktindynamik einschließlich Zelladhäsion, Migration und Morphologie wichtig ist. In dieser Untersuchung werden wir das CRE LAX P-System verwenden, um dieses Gen zu entfernen und seine Rolle in der Zelle zu bestätigen. Zuvor wurden Fibroblastenzellen von embryonalen Mäusen mit einem beflockten Gestell mit einem Allel 12 Tage nach der Befruchtung isoliert.

Diese Zellen wurden dann zur Langzeitlagerung in flüssigen Stickstoff gelegt, und wir beginnen mit dem Auftauen eines einzelnen Fläschchens dieser Zellen, die einen Embryo darstellen. Bei der Durchführung von Zellkulturexperimenten ist es wichtig, dass eine sterile Umgebung aufrechterhalten wird. Dazu gehören das Abwischen der freiliegenden Oberflächen einer zugelassenen Strömungshaube sowie das Besprühen aller Reagenzflaschen und Laborgeräte, die in die Haube gelangen, mit 70 % Ethanol.

Sobald die Strömungshaube vorbereitet wurde, tauen Sie die Zellen auf, indem Sie das Fläschchen in ein Becherglas mit 37 Grad Celsius heißem Wasser tauchen, bis der Inhalt flüssig ist. Als nächstes sterilisieren Sie das Fläschchen mit 70% Ethanol und fügen Sie dann die Zellsuspension hinzu. Tropfen weise auf eine 10 Zentimeter große Platte mit neun mil DMEM, einem Medium mit hohem Glukosegehalt, das mit 10 % fötalem Rinderserum und 1 % Penicillin ergänzt wurde.

Streptomycin schüttelt die Platte vorsichtig, um die Zellen zu verteilen, und legen Sie sie in den 37-Grad-Inkubator mit 5 % CO2, wobei Sie daran denken, die Platte mit den entsprechenden Informationen zu beschriften. Die Zellen erreichen in der Regel innerhalb von 24 Stunden eine 100%ige Co-Flüssigkeit. An diesem Punkt können wir die Zellen auf eine neue Platte übertragen.

Um dies zu tun, beginnen Sie damit, die alten Medien abzusaugen. Fügen Sie fünf mil steriles PBS hinzu, um die Zellen zu spülen, und entfernen Sie dann auch dieses. Fügen Sie nun eine mil Trypsin mit 10 Millimolar EDTA hinzu.

Legen Sie die Platte für etwa fünf Minuten in den 37-Grad-Inkubator, damit sich die Zellen vom Substrat lösen können. Kehren Sie zur Strömungshaube zurück und geben Sie neun mil Medium zurück in die tryps inisierte Platte, wodurch die Zellen eins zu 10 verdünnt werden, pipettieren Sie die Flüssigkeit mehrmals auf und ab, um Zellklumpen aufzubrechen, und entfernen Sie dann einen mil der Suspension und fügen Sie sie tropfenweise zu neun mil frischem Medium in einer neuen 10-Zentimeter-Platte hinzu. Schütteln Sie die Platte wieder vorsichtig, um die Zellen zu verteilen, und legen Sie sie in den 37-Grad-Inkubator.

Wenn die Zellen die Konfluenz erreicht haben, werden sie im nächsten Schritt auf gläserne Deckgläser gesät, damit sie mikroskopisch betrachtet werden können. Bereiten Sie die Zellen mit der gleichen Technik vor, die auch für die Verpackung bis hin zum Hinzufügen von Trips in die Zellen und dem Platzieren in den 37 Grad Celsius Inkubator verwendet wird. Während die Zellen von der Platte abheben, bereiten Sie eine Sechs-Well-Schale mit Glas-Deckgläsern zu, indem Sie einen autoklavierten Deckglas pro Vertiefung verwenden.

Sobald sich die Zellen von der Platte gelöst haben, geben Sie fünf bis sechs mil Medium zurück zu den tryps-inisierten Zellen. In der nächsten Phase des Experiments werden Zellzählungen durchgeführt, damit eine angemessene Anzahl von Zellen für eine effiziente Virusinfektion platziert werden kann. Um die Zellen zu zählen, kombinieren Sie 15 Mikroliter Probe mit einem gleichen Teil Trianblau-Pipette nach oben und unten, mischen Sie und geben Sie 15 Mikroliter dieser Lösung in das Hämozytometer.

Tote Zellen erscheinen blau: Bei dieser Zubereitung werden nur die lebenden oder farblosen Zellen auf dem Vier-mal-Vier-Raster gezählt, um die Anzahl der Zellen pro Mikroliter zu berechnen. Beginnen Sie damit, Zellen in vier separaten Rastern (A bis D) zu zählen und den Durchschnitt zu ermitteln. Multiplizieren Sie dann diesen Wert mit zwei, um die Verdünnung in Trianblau zu berücksichtigen.

Da das Gitter ein Zehntel eines Mikroliters enthält, multiplizieren Sie mit 10, um die Zahl in Zellen pro Mikroliter auszudrücken. Bestimmen Sie anschließend das erforderliche Volumen, indem Sie die gewünschte Anzahl von Zellen durch die zuvor berechnete Zellkonzentration dividieren. Fügen Sie das berechnete Volumen der Zellsuspension tropfenweise in jede Vertiefung der sechs Schweißschalen hinzu.

Lassen Sie diese Zellen über Nacht im 37-Grad-Inkubator. Am nächsten Tag wird das Virus zu den Zellen hinzugefügt. Das Den-Creek-Virus, das aus den Vector B-Labors gewonnen wurde, war aliquot und lagerte bei minus 80 Grad Celsius.

Holen Sie dieses Virus zurück und kehren Sie zur Abflusshaube zurück. Nehmen Sie die Sechs-Well-Schale aus dem Inkubator und bringen Sie sie zur Haube. Aspirieren Sie das Medium und waschen Sie die Zellen mit einer mil serumfreiem DMEM.

Geben Sie nun eine mil serumfreies Medium in jede Vertiefung für die Zugabe des Virus. Für die virale Anwendung verwenden wir eine Multiplizität von Infektionen oder MOI von 500. Zuvor wurde die Protokolloptimierung mit verschiedenen MOIs durchgeführt, und wir fanden heraus, dass ein MOI von 500 hocheffiziente Infektionsraten mit geringen oder keinen Auswirkungen auf die Zellviabilität lieferte.

Um das Trägheitsmoment zu berechnen, verwenden Sie die folgende Gleichung. Beginnen Sie mit der Berechnung der Anzahl der erforderlichen Viren, was durch Multiplikation des Ziel-MOI, in diesem Fall 500 mit der Anzahl der Zellen pro Well, oder 30.000 erreicht werden kann, um das Volumen des zu verwendenden Virusbestands zu bestimmen, multiplizieren Sie die Viruszahl mit 1000 und dividieren Sie dies durch die Anfangskonzentration des Virus. In diesem Fall geben wir 1,5 Mikroliter Virusfond in jede Vertiefung, die infiziert werden soll.

Schütteln Sie die Platte vorsichtig, um das Virus zu verteilen, und stellen Sie die Platte über Nacht in den 37-Grad-Inkubator. Entfernen Sie am nächsten Morgen das Virusmedium aus den Zellen, waschen Sie es mit PBS und fügen Sie den Zellen zwei mil normales Medium hinzu. In diesem Experiment fanden wir heraus, dass phänotypische Veränderungen in den Zellen innerhalb von etwa 72 Stunden auftraten.

Zellen, die mit dem Acton-Din gefärbt wurden, wurden mit dem konfokalen Laser-Scanning-Mikroskop Leica T-C-S-S-P mit fünf Multiphotonen am Advanced Analysis Center der University of Guelph abgebildet. Dabei zeigten sich Veränderungen in der Morphologie zwischen infizierten und nicht infizierten Zellen. Diejenigen, denen RAC one fehlt, erscheinen länglich und dünn im Vergleich zu den breiten, abgeflachten Zellen, die nicht infiziert wurden.

Hier haben wir gezeigt, dass das ADOC-Rillsystem eine robuste Methode für eine effiziente Genabgabe an Zellen ist, die über die Untersuchung der Signaltransduktion hinausgeht. Sie können diese Methode jedoch auch verwenden, um Gene in Versuchstieren auszuschalten oder um bestimmte Zellpopulationen in einem Organismus zu markieren. Das Adenovirus-System kann auch verwendet werden, um andere Gene als Cree in das Prinzip einzuführen.

Zu den Vorteilen dieser Verabreichungsmethode gehören die hohe Affektion, die Effizienz und die mangelnde Integration in die DNA der Wirtszelle. Die Erzeugung eines gängigen Adenovirus kann jedoch arbeitsintensiv sein. Das hier beschriebene Protokoll nutzt daher die Leistungsfähigkeit des adenoviralen Systems unter Verwendung des zuvor entwickelten Ocre-Virus mit unserem beflockten RAC one mes durch diesen bedingten Knockout, das haben wir gezeigt.

Die Morphologie ist also in der Tat teilweise abhängig von dem kleinen GTP als dem RAC-Morphp. Abschließend möchten wir vom Jones Lab uns nur für das Anschauen unseres Videos bedanken und viel Glück bei all Ihren zukünftigen Forschungen.