ניתוח של שוואן-astrocyte אינטראקציות שימוש במבחנה מבחני

תאי שוואן הם תאי גליה של מערכת העצבים ההיקפית ששימשו לתיקון פגיעות בחוט השדרה. בעיקרון, גורמי גדילה התומכים בהתחדשות אקסונלית ומספקים הידבקות מקדמת צמיחה ומולקולות מטריצה חוץ-תאיות. נוסף על כך, הם מיאלינטים אקסונים במקום הפציעה.

לרוע המזל, תאי ברבור מושתלים אינם נודדים מאתר השתלים ואינם מתערבבים עם האסטרוציטים המארחים. התוצאה היא היווצרות גבול חד ומונעת מאקסונים גדלים להשתלב ברקמת המארח. בסרטון זה, שתי שיטות משמשות לחקר האינטראקציות בין תאי ברבור ואסטרוציטים במבחנה.

ראשית, מודגמת בדיקת גבול שבה טריטוריות של תאי ברבור ואסטרוציטים מוקמות על מגלשה ומתורבתות. לאחר מכן מתווספים ריאגנטים שונים לשקופית ובעקבות תרבית נוספת. לאחר מכן השקופיות מצולמות ומנותחות כדי לקבוע את השפעת הריאגנטים על נדידת תאי הברבור לטריטוריה האסטרוציטית או להיפך.

לאחר מכן, מודגמת בדיקת נדידה שבה שברי החלקת כיסוי מכוסים בקנים של תאי ברבור הופכים על חד-שכבות אסטרוציטים. שוב, ריאגנטים שונים מתווספים למדיום התרבית, ולאחר הדמיית תרבית מבוצעת כדי להעריך את היקף ומרחק הנדידה של תאי שוואן על חד-שכבות אסטרוציטים. בסופו של דבר, סוג זה של בדיקה אמור להקל על פיתוח אסטרטגיות לייעול ושיפור האינטגרציה של שתלי תאי שוואן לאחר ההשתלה.

היתרון של מבחני מבחנה אלה על פני השיטות הקיימות שבהן מוערכת נדידה על מצעים טהורים הוא שזה רלוונטי יותר למבחני in vivo שבהם תאים מושתלים באים במגע עם אסטרוציטים. בנוסף, ניתן להשתמש במבחני מבחנה אלה בתחומים אחרים כגון ביולוגיה של התא כדי לענות על שאלות מפתח כגון פלישת תאי גידול ונדידה. לפני תחילת הבדיקה יש בהישג יד את הפריטים הבאים, שקופיות תא מצופות פולי D ליזין, שקופיות זכוכית סטריליות, מדיום תרבית תאים ובקבוק סידן.

פתרון מקור האיזון של הנקס ללא מגנזיום מתחיל בטריפסין תאי רשואן ראשוניים למשך שלוש דקות ואסטרוציטים ראשוניים של חולדות למשך חמש דקות. לאחר שהתאים התנתקו והפעילו את הטריפסין על ידי הוספת מדיום תרבית תאים. לאחר מכן, העבירו את תאי השוואן והאסטרוציטים כדי להפריד צינורות בז של 15 מיליליטר וצנטריפוגה אותם בכוח הכבידה פי 300 למשך חמש דקות.

בינתיים, בעזרת חותך זכוכית חתוך מכסה זכוכית מלבני מחליק לאורך כך שיתאים לרוחב מגלשות התא המשמשות לבדיקות גבול ויכול להקל על מריחת טיפת מתלה התא. לאחר הספין Resus, השעו את תאי השוואן והאסטרוציטים בצפיפות של שניים כפול 10 לששת התאים למיליליטר. בקצה אחד של מגלשת תא מצופה פוליליזין, הניחו היטב טיפה אחת של 50 מיקרוליטר של תרחיף תאי שוואן.

השתמש ברצועת זכוכית כדי למרוח את הטיפה לכיוון מרכז החדר כדי ליצור קצה ישר. לאחר מכן, הניחו טיפה שנייה של 50 מיקרוליטר של תרחיף אסטרוציטים בקצה הנגדי של אותה באר ומרחו אותה לכיוון המרכז. כדי ליצור קצה ישר במקביל לראשון, צריך להיות פער של 0.2 מילימטר ביניהם.

הנח את מגלשת החדר המכילה את הטיפות באינקובטור בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך שעתיים. אחרי שעתיים. שטפו את התרביות עם DMEM כדי להסיר כל פסולת סלולרית שאינה מחוברת.

כדי לעורר את התפשטות תאי הברבור, הוסף מדיום למגלשות החדר. מדיום זה מתווסף עם ארבעה גלין ותמצית יותרת המוח של בקר. ארבעת הגאלין מעלים את רמות ה-A MP המחזוריות בתוך תאי השוואן כדי לגרום לשגשוג וה-BPE יספק גורמי גדילה הדרושים לתרבית ארוכת טווח.

דגרו על המגלשה למשך שמונה עד 10 ימים. שתי חזיתות התאים יגיעו בסופו של דבר זו לזו וייווצר גבול חד בין שני סוגי התאים. בשלב זה ניתן לבצע ניסויים.

ניתוח גורמים המעורבים בהיווצרות גבולות כדי לבחון את הגבול, לתקן את התרבות המשותפת עם 4% פורמלדהיד. כדי להבחין בין תאי ברבור ואסטרוציטים מבצעים צביעה חיסונית עם נוגדן נגד P 75 ונוגדנים נגד GFAP בהתאמה. נוגדן P 75 מזהה את קולטן ה-NGF בעל הזיקה הנמוכה בתאי שוואן, שחסר לאסטרוציטים נוגדן אנטי GFAP מזהה חלבון חומצי סיבי גליה, אשר מתמקם באסטרוציטים כדי לבצע בדיקת נדידה.

התחל את הציפוי שלי. אחת כפול 10 לחמשת האסטרוציטים במיליליטר אחד של תווך בכל באר של צלחת ארבע בארות עם בארות של 15 מילימטר. מניחים את הצלחת בחממה של 37 מעלות צלזיוס למשך 24 עד 48 שעות עד שהחד-שכבה מתכנסת לחלוטין.

בינתיים, כדי להכין תאי ברבור כדי להעריך את הנדידה על חד-שכבות אסטרוציטים, הניחו כיסוי זכוכית עגול מצופה פוליליזין בצינור של 50 מיליליטר והשתמשו במוט פלסטיק כדי לרסק אותם, וליצור שברי זכוכית קטנים. מעבירים את שברי הזכוכית לבאר אחת של צלחת שש בארות ואז בעזרת מלקחיים. בחר שברים ברוחב של כחמישה מילימטרים והעביר חמישה לכל אחת מהבארות האחרות.

תאי הברבור הראשוניים של טריפסין i למשך שלוש דקות. לאחר מכן העבירו את התאים לצינור של 15 מיליליטר וצנטריפוגה אותם בכוח הכבידה פי 300 למשך חמש דקות. Re השעו את תאי השוואן פעמיים פי 10 עד ששת התאים למיליליטר במדיום התרבית.

לאחר מכן הוסיפו 20 מיקרוליטר של תרחיף תאי השוואן על כל שבר ודגרו בחום של 37 מעלות צלזיוס ו-7% פחמן דו חמצני למשך שעתיים. לאחר שעתיים, הוציאו את תאי השוואן מהחממה. הוסף מספיק מדיום תרבית בתוספת שתי מיקרומולר, ארבע אבנית ו-10 מיקרוגרם למיליליטר BPE לכל באר.

אז השברים עם התאים המחוברים מכוסים לחלוטין בדגירה בינונית למשך 24 עד 48 שעות עד ששברי הזכוכית מתחברים לחלוטין לתאי הברבור. לאחר שהשברים מחוברים לתאי ברבור, שלפו גם תאי ברבור וגם אסטרוציטים מהחממה. השתמש במלקחיים כדי להרים בזהירות כל שבר עם תאי ברבור מחוברים.

טבלו את השבר ב-HBSS כדי להסיר תאים לא מחוברים ולאחר מכן הפכו אותו עם הפנים כלפי מטה על האסטרוציטים החד-שכבתיים. לאחר שכל השברים הועברו. הוסף מיליליטר אחד של מדיום תרבית תאים לכל באר.

אם יוערכו ההשפעות של ריאגנטים ניסיוניים כגון גורמי גדילה, יש לכלול אותם במדיום. החזירו את הצלחת לאינקובטור ואפשרו לתאי השוואן לנדוד במשך 24 עד 48 שעות לאחר תקופת הנדידה. שברי הזכוכית מקובעים לתחתית כל באר על ידי הוספת 4%para formaldehyde למשך 30 דקות לאחר הקיבוע.

צביעה חיסונית של תאי השוואן עבור P 75, ולאחר מכן צביעה אותם באמצעות ערכת A BC Strept ADIN שסופקה DIAM benadine כדי לאפשר הדמיה של תאי השוואן תחת מיקרוסקופ אור לאחר 10 ימים. תרבית אסטרוציטים של שוואן מראה גבול חד בין שני סוגי התאים. הנה. תאי שוואן מזוהים על ידי P 75.

צביעה של קולטן NGF בעל זיקה נמוכה ומוצגים באסטרוציטים אדומים מזוהים על ידי צביעת GFAP המוצגת בירוק. הגבול בין תאים אלה בולט יותר אם משתמשים בפורסקולין ו-BPE בתרבית מכיוון שריבוי תאי שוואן מוגבר. לעומת זאת, בבדיקת תרבית משותפת זו של 10 ימים, התאים לא הופרדו היטב לטריטוריות שונות.

זאת בשל הטכניקה הגרועה והערבוב של שני סוגי התאים. בעת הכנת מבחן הגבול, מבחני הגירה מעריכים תנועה של סוג תא אחד על פני השטח של סוג תא אחר, ולכן מעריכים תופעה שונה מזו של היווצרות גבול. תמונה זו מציגה תאי ברבור נודדים הרחק מקצה החלקת הכיסוי, החץ מצביע על כיוון נדידת התאים.

בעת ניסיון מבחני מבחנה אלה, חשוב לזכור שהשפעת הריאגנטים יכולה להיות על אסטרוציטים או תאי שוואן, ולכן נדרשים ניסויים עוקבים על מנת להראות בדיוק איזה סוג תא אחראי לנדידה הנצפית, המוגברת או המופחתת. בנוסף, ניתן לבצע טכניקות אחרות כמו אימונוכימיה ובמיוחד בבדיקת הגבול על מנת להראות אילו מולקולות מווסתות או מווסתות כלפי מטה בגבול שבין תאי שון לאסטרוציטים.