印记基因的DNA甲基化的测定拟南芥胚乳

该程序的总体目标是确定胚乳中印记基因的 DNA 甲基化状态。这是通过首先阉割女性父母来实现的。然后，雌性亲本用雄性亲本的花粉授粉。

接下来，将胚乳从异花授粉的种子中解剖出来。该程序的最后一步是对胚乳 DNA 进行硫酸氢盐测序。最终，通过不同生态型的 DNA 测序多态性和硫酸氢测序，可以获得显示印记基因母系或父系等位基因的 DNA 甲基化状态的结果。

大家好，我是圣路易斯大学生物系的 Yang Shaw 博士。大家好，我是圣路易斯大学 Dr.J Lab 和生物系的 Matthew Ray。我是 J 博士实验室的 Diman Panu。

今天，我们将向您展示解剖橄榄球官员并通过硫 FAR 测序确定 DNA 冰毒状态的程序。我们在实验室中使用该程序来研究受 DNA 甲基化和去甲基化调节的基因印记。那么让我们开始吧。

要开始此过程，请选择两种不同的拟南芥生态型作为女性和男性亲本，以便通过使用 DNA 序列多态性来区分母系和父系等位基因。在这里，Columbia zero 和 Landsberg Erecta 分别被选为雌性和雄性亲本。注意选择年轻健康的植物。

解剖显微镜的帮助下阉割女性亲本。找到第 12 阶段的花朵，并用剪刀剪住基座的底部，去除它们上方和下方的任何花朵或 LIC。通过将尖端底部轻轻浸入 95% 乙醇的烧杯中对镊子进行消毒。

这将去除镊子上的任何花粉粒并杀死花粉。用镊子轻轻撬开花蕾，小心地取出四个花序、四个花瓣和六个雄蕊，使手枪裸露且完好无损。在此过程中尽量避免损伤腕骨。

下一步是挑选花粉供体并进行授粉，最好的花粉 Don 是，并在第 14 阶段开花，花瓣以 90 度角延伸到手枪，其中大量花粉脱落。抓住花的底部和基座上方，这会导致花散布开阔的灰尘。准备好的手枪与花药的柱头。

授粉后，柱头上会覆盖着黄色的花粉，在显微镜下可以很容易地观察到。在一株植物上为所有被阉割的手枪授粉后，用珠宝标签标记十字架。包括女性和男性父母的日期和信息。

在靠近植物的土壤中放置一根木桩。用绳子将 in 荧光的茎系在木桩上，并用塑料袋盖住授粉手枪。在授粉或 DAP 后 7 或 8 天，种子应该准备好在胚胎发生的中后期鱼雷阶段收获并解剖。

对于胚乳和胚胎，将 8 DAP 水杨置于解剖显微镜下。使用一对镊子握住 EK P 细胞，并使用另一对镊子的尖端滑开两根腕骨融合处边缘的鞋底。使用一对 BPS 拾取一颗种子并将其放在载玻片上。

然后在微绒末端做一个小切口，使胚胎滑出。挤压未切割的一端，将胚乳推出，并将其与种皮分离。接下来，将胚胎和胚乳放入单独的微管和液氮中。

继续这样做，直到从 10 到 15 个 CLIC 积累足够的胚胎或胚乳。然后在亚硫酸氢盐处理之前将试管存放在零下 80 摄氏度的冰箱中。使用微妙的三甲基溴化铵或 CTAB 程序分离基因组胚乳或胚胎 DNA。

分离出胚乳基因组 DNA 后，用切开待分析区域外的限制性内切酶，在 20 μL 总体积的反应中消化 100 ng。对于 ME 启动子限制性内切酶，使用 xh、O 1、ND 和 PST 1。通过将 DNA 煮沸 5 分钟来使限制性内切酶变性。

然后在冰上淬灭反应。加入 1 9 体积或 2.2 微升 3 摩尔氢氧化钠，并在 37 摄氏度下孵育 15 分钟。孵育后，将溶液转移到 250 μL PCR 管中。

接下来，制作 6.24 摩尔的尿素。通过将 7.5 克尿素溶解在 10 毫升无菌蒸馏水中，在加热和搅拌溶液的同时，在 7.6 克间位钠中缓慢加入亚硫酸盐溶液，在一到两个小时内得到四摩尔亚硫酸钠溶液。溶解后，用新鲜制备的 10 摩尔氢氧化钠将 pH 值调节至 5。

加入无菌蒸馏水至最终体积为 20 mL。将 208 微升此溶液转移到 22.2 微升变性胚乳基因组 DNA 中。然后向 DNA 中加入 12 微升新鲜制备的 10 毫摩尔对苯二酚。

在 PCR 机器中进行亚硫酸氢盐处理，在 55 摄氏度下循环 30 次，持续 15 分钟，然后在 95 摄氏度下进行 30 秒。接下来，使用 Promega 的向导 DNA 纯化系统对亚硫酸氢盐处理的 DNA 进行脱盐。根据制造商的说明，测量脱盐后从色谱柱中回收的 TE 的确切体积。

然后在 6.3 摩尔氢氧化钠中达到最终浓度为 0.3 摩尔。将混合物在 37 摄氏度下孵育 15 分钟。孵育后，加入 10 摩尔乙酸铵至终浓度为 3 摩尔、2 微升/微升 20 微克 TRNA 和三体积的 100% 乙醇。

混合样品并以 14， 000 RPM 离心 15 分钟。用 70% 乙醇洗涤沉淀一次，然后用短离心机去除多余的乙醇。最后，将沉淀快速干燥 5 分钟，并重悬于 25 μL TE 缓冲液中。

经钠 BI cite 处理的 DNA 现在可用于 PCR 分析。为了对 4 kb Madea 启动子进行测序，请设计多组引物并扩增 14 个重叠片段以覆盖整个区域。首先设计正向引物对顶部链进行排序。

首先，选择一个富含 Guine 的区域，以获得更高的退火温度，而引物中没有额外的长核苷酸。接下来，在 CG 和 C NG 环境中将胞嘧啶更改为 perine。然后将任何其他胞嘧啶换成胸腺嘧啶。

在设计反向引物时，选择富含胞嘧啶的区域。在 CG 和 CNG 上下文中将 guine 更改为 purine，将任何其他 guine 更改为腺嘌呤。要再次对底部链进行测序，请先设计正向引物。

选择一个富含胞嘧啶的区域，并在 CG 和 CNG 环境中将 guine 更改为嘌呤。将其他 guines 改为腺嘌呤。在设计反向引物时，选择 AINE 富集区域。

在 CG 和 CNG 环境中将胞嘧啶更改为帕啶，并将剩余的胞嘧啶更改为胸腺嘧啶。设计引物后，使用两微升亚硫酸氢钠处理的 DNA 作为每次 PCR 扩增的模板，制备 PCR 反应。运行 PCR 反应并通过凝胶电泳分析产物，以确认片段大小正确。

下一个凝胶。纯化 PCR 产物并将其克隆到体外 topo TA 克隆载体 PCR 2.1 中。作为插入片段和测序单个克隆，亚硫酸氢盐测序的原理是，在 pH 值为 5.0 时，亚硫酸盐通过高浓度钠进行水解脱氨作用，未甲基化的胞嘧啶将转化为尿嘧啶。

相反，五甲基胞嘧啶不会被亚硫酸盐钠修饰。尿嘧啶将在 PCR 产物中作为胸腺嘧啶扩增，而甲基化胞嘧啶在 PCR 扩增后仍保留胞嘧啶。获得测序结果后，将其与用于 PCR 扩增的链特异性模板进行比较。

如果模板中的胞嘧啶残基在测序结果中读作胸腺嘧啶，则表明胞嘧啶未甲基化。如果模板中的细胞因子残基在测序结果中仍然是胞嘧啶，则意味着胞嘧啶被甲基化，母体 MEA 等位基因在 MEA 启动子的负 500 碱基对区域中的甲基化状态，对于哥伦比亚测序克隆中的五个甲基化 CPG 位点，g Clarus 与 RLD 胚乳杂交显示甲基化胞嘧啶由黑色实心圆圈表示，未甲基化胞嘧啶由白色未填充圆圈表示。同样，显示了 Columbia 的母系 Madea 等位基因的甲基化状态，Gladys 与 RLD 胚胎杂交。

我们刚刚向您展示了在执行此过程时如何分离胚乳并通过亚硫酸盐测序进行。请务必记住正确遵循协议。就是这样。

感谢您的观看，祝您的实验好运。