Name: قياس الكمي GLUT4 إزفاء إلى غشاء البلازما التي التدفق الخلوي (فيديو) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-11-07T17:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 39 s
Description: تعلم قياس انتقال GLUT4 إلى غشاء البلازما باستخدام تقنية التدفق الخلوي في خلايا العضلات. تساعد هذه الطريقة الباحثين على دراسة استجابة الجلوكوز للأنسولين واضطرابات التمثيل الغذائي.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

وأيد هذا العمل من المنح المقدمة من السيدة كليفورد غراهام الابيض إلدر هبوا صندوق البحوث والمعاهد الوطنية للصحة (AR059838) لبناء القدرات ، من المعاهد الوطنية للصحة (AR052791 ، AR044387 - الأذربيجانية ، وNS063298) لLTT ، وكلية بايلور للطب الخلوي والخلية الأساسية الفرز بتمويل من المعاهد الوطنية للصحة (NCRR S10RR024574 ، NIAID AI036211 ، وP30CA125123 NCI). المحتوى هو فقط من مسؤولية الكتاب ولا تمثل بالضرورة وجهة نظر رسمية من المعاهد الوطنية للصحة.

1. خلية يلطخ <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحضير الخلايا. وينبغي أن تستخدم الخلايا في حين لا يزال بنشاط متزايد (60-80 التقاء ٪). مصل تجويع الخلايا بين عشية وضحاها ، وخلايا لوحة لهم عند 0.1 مليون برميل في المتوسط ​​0،5 جيدا في المصل خالية مل في صفيحة ال 24 جيدا ووضعه في الحاضنة (37 درجة مئوية ، 5 ٪ CO 2) لمدة 30 دقيقة -- 2 ساعة لاسترداد من trypsinization. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مزيج الأجسام المضادة الابتدائية والثانوية. مزيج (5 ميكرولتر من الأجسام المضادة لمكافحة GLUT4 الأولية مع 1 ميكرولتر الضد الدجاج الثانوية مفتش مكافحة الماعز مترافق لAlexaFluor 488) x عدد الآبار. احتضان لمدة 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة ، في الظلام. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد المخزون 2X عمل الانسولين عن طريق تمييع في المتوسط. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحقق مما إذا الخلايا انضمت أم لا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة بلطف 6 مزيج الأجسام المضادة ميكرولتر و0.5 مل من المخزون الخاص 2X عمل الانسولين في الآبار التي تحتوي على الخلايا. تجنب أي اضطراب في المتوسط. احتضان (37 درجة مئوية ، 5 ٪ CO 2) لمدة 30 دقيقة ، في الظلام. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إصلاح الخلايا عن طريق إضافة 0.5 مل من برنامج تلفزيوني PFA + 1 ٪ على كل جانب ، دون أن تهتز الخلايا. احتضان لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة ، في الظلام. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إذا كان لديك الخلايا انضمت إلى الآبار ، ورفع بلطف لهم رافع الخلية. نقل الخلايا (1 مجموع مل) في الأنابيب التي تناسب في تدفق عداد الكريات الخاص وأجهزة الطرد المركزي لخلايا بيليه. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تغسل مرتين مع بيليه في برنامج تلفزيوني مل 1 و resuspend في برنامج تلفزيوني 0.4 مل + 1 ٪ PFA. عند هذه النقطة ، يمكن أن تكون ملفوفة في احباط الخلايا وتخزينها في الثلاجة (4-8 درجة مئوية) ، أو نقله إلى تدفق عداد الكريات للحصول على البيانات الفورية. </li></ol> 2. الحصول على البيانات <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مجموعة بوابة واسعة حول الخلايا الحية في الجانب مبعثر (SSC) مقابل قدما مبعثر لوحة (FCS). استخدام أنبوب السلبية (خلايا لا تعامل مع الأنسولين أو الخلايا "ملطخة" مع عنصر تحكم isotype) لتعيين المعلمة FL1. تأكد الخاص بك هو ذروة تماما في لوحة ، وليس بقطع في الجانب السفلي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الحصول على البيانات من ما لا يقل عن 10000 الخلايا في الأنبوب. </li></ol> 3. تحليل البيانات <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> رسم بوابة حول الخلايا الحية في لوحة SSC FSC مباراة (الشكل 1A). رسم رسوم بيانية للكثافة مضان مقابل 488 AlexaFluor عدد الخلايا الحية داخل بوابة خلايا (1B الشكل). يمكنك تراكب رسوم بيانية تصور مختلف لاختلاف الكميات ولكن ل، وتحديد كثافة وسيطة يعني مضان لكل خلية السكان واستخدام هذه الأرقام لإجراء مقارنات الخاص (الشكل 1C). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تطبيع البيانات إلى القيمة التي تم الحصول عليها في غياب الأنسولين ، كما هو مبين في الأرقام و1C 1D. </li></ol> 4. ممثل النتائج في myoblasts معزولة عن فرد صحية (أي مقاومة الانسولين) ، الانسولين يؤدي الى إزفاء تعتمد على الجرعة من GLUT4 من السيتوبلازم إلى غشاء البلازما (الشكل 1 ، يسار). في المقابل ، لا تحفز الانسولين GLUT4 إزفاء إلى غشاء البلازما myoblasts عزلها من المريض مع مقاومة الانسولين (الشكل 1 ، يمين). <img src="/files/ftp_upload/2429/2429fig1.jpg" alt="الشكل 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="الشكل 1"> الشكل 1. مثال تجربة تلوين. وقد تم عزل Myoblasts من متبرع دون مقاومة الانسولين (يسار) ومن مريض مع مقاومة الانسولين (يمين) ألف ، SSC (مبعثر الجانب) مقابل FCS (مهاجم مبعثر) مؤامرة مع بوابة حول الخلايا الحية. باء ، في خلايا بوابات A ، ملطخة الأضداد ضد حاتمة GLUT4 الخارجية ، وترك unstimulated (الحمراء) أو حفز مع نانومتر 1 الانسولين (الأزرق) ، 10 نانومتر (البرتقال) ، أو 100 نيوتن متر (الخضراء). لوضوح الشكل ، وتبين لنا فقط البيانات دون و100 نانومتر مع الانسولين للخلايا مقاومة الانسولين. C ، متوسط ​​كثافة مضان (MFI) من رسوم بيانية تظهر في وباء طبيعية لمؤسسات التمويل الأصغر من الخلايا unstimulated اليسار (لا الانسولين). D ، قطع من البيانات من مؤسسات التمويل الأصغر تطبيع رسوم بيانية تظهر في B.

<ol><li>Zhao, F. Q., Keating, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+properties+and+genomics+of+glucose+transporters%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Genomics%22%5BJournal%5D)">Functional properties and genomics of glucose transporters.</a> Curr. Genomics. 8, 113-128 (2007).</li>
<li>Karnieli, E., Armoni, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+regulation+of+the+insulin-responsive+glucose+transporter+GLUT4+gene%3A+from+physiology+to+pathology%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Endocrinol.+Metab%22%5BJournal%5D)">Transcriptional regulation of the insulin-responsive glucose transporter GLUT4 gene: from physiology to pathology.</a> Am. J. Endocrinol. Metab. 295, 38-45 (2008).</li>
<li>Graham, T. E., Kahn, B. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue-specific+alterations+of+glucose+transport+and+molecular+mechanisms+of+intertissue+communication+in+obesity+and+type+2+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Horm.+Metab.+Res%22%5BJournal%5D)">Tissue-specific alterations of glucose transport and molecular mechanisms of intertissue communication in obesity and type 2 diabetes.</a> Horm. Metab. Res. 39, 717-721 (2007).</li>
<li>Alter, G., Malenfant, J. M., Altfeld, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD107a+as+a+functional+marker+for+the+identification+of+natural+killer+cell+activity%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Methods%22%5BJournal%5D)">CD107a as a functional marker for the identification of natural killer cell activity.</a> J. Immunol. Methods. 294, 15-22 (2004).</li>
<li>Vermes, I., Haanen, C., Steffens-Nakken, H., Reutellingsperger, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+assay+for+apoptosis.+Flow+cytometric+detection+of+phosphatidylserine+expression+on+early+apoptotic+cells+using+fluorescein+labeled+Annexin+V%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Methods%22%5BJournal%5D)">A novel assay for apoptosis. Flow cytometric detection of phosphatidylserine expression on early apoptotic cells using fluorescein labeled Annexin V.</a> J. Immunol. Methods. 184, 39-51 (1995).</li>
<li>Lugli, E., Roederer, M., Cossarizza, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Data+analysis+in+flow+cytometry%3A+the+future+just+started%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">Data analysis in flow cytometry: the future just started.</a> Cytometry A. 77, 705-713 (2010).</li>
</ol>

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

لقد أثبتنا تقنية سريعة لقياس إزفاء من GLUT4 من السيتوبلازم إلى غشاء البلازما من الخلايا التدفق الخلوي. وأعرب هو عابر فقط GLUT4 في غشاء الخلايا والبلازما هي endocytosed. منذ أضداد ملزمة تظل مرتبطة GLUT4 ، حتى خلال الإلتقام ، ويعطي إشارة مضان المبلغ الإجمالي للGLUT4 التي تعرضت في غشاء البلازما خلال فترة الحضانة للاختيار في وجود الانسولين. ويمكن أيضا أن تطبق هذه التقنية لدراسة إزفاء من البروتينات الأخرى من حجرة داخل الخلايا لغشاء البلازما ، وقدم جيدة الأضداد الموجهة إلى حاتمة الخارجية للبروتين من الفائدة المتاحة. على سبيل المثال ، يتم الآن فحص مشابهة تستخدم عادة لتقييم معدل تحبب الخلايا اللمفاوية التائية السامة القاتلة الطبيعية والخلايا الليمفاوية عن طريق قياس إزفاء من CD107a لغشاء البلازما من 4،5. يمكن أيضا أن إزفاء من فسفاتيديل من الجانب الداخلي للغشاء البلازما إلى الجانب الخارجي خلال موت الخلايا المبرمج أو نخر الخلية يمكن الكشف عنها بواسطة التدفق الخلوي ، وذلك باستخدام fluorophore المسمى Annexin الخامس 6. بالإضافة إلى سرعة في الفحص ، التدفق الخلوي يقدم ميزة تسمح للدراسة إزفاء البروتين إلى غشاء البلازما في الخلية المختلطة السكان. في الواقع ، يمكن للمرء أن يجمع بين تلطيخ لعلامات فرعية الخلايا والبروتين للاهتمام ، يليها الحصول على البيانات على تدفق عداد الكريات متعددة الليزر 7. كميات من الأجسام المضادة الواردة في الفقرة 1.2 من البروتوكول هي نقطة الانطلاق ، ونحن نوصي معايرة الأضداد الخاص بخلايا اهتمامك لتحديد الحد الأدنى من تركيز الأجسام المضادة التي تمنحك إشارة الأقصى. ومن شأن مجموعة انطلاق جيدة لجسم الإنسان الأولية لمكافحة GLUT4 استخدمناها هنا سيكون ميكرولتر 10-10 في أنبوب (أي الأضداد ميكروغرام 0،2-2 في الأنبوب) ، كل أنبوب لا تحتوي على أكثر من 1 مليون خلية. عن الأجسام المضادة الأولية الأخرى ، يرجى الرجوع إلى تعليمات المورد. تطبيع البيانات اللازمة كما تألق ذاتي للخلايا وسوف تختلف من مانح إلى آخر ومن تجربة إلى تجربة.

<table><tbody><tr><td>الأجسام المضادة لـ GLUT4 البشرية</td><td>Santa Cruz Biotechnology, Inc.</td><td>sc-1606</td><td>ضد حاتمة خارجية لـ GLUT4</td></tr><tr><td>جسم مضاد من الدجاج ضد IgG الماعز مقترن بـ AlexaFluor 488</td><td>Invitrogen</td><td>A-21467</td><td></td></tr><tr><td>إنسولين بشري معاد التركيب</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I2643</td><td></td></tr><tr><td>رافعات الخلايا</td><td>VWR international</td><td>29942-118</td><td>تُقص لتناسب الآبار</td></tr><tr><td>أنابيب سعة 5 ml لتحليل FACS</td><td>VWR international</td><td>60819-138</td><td>تناسب جميع أجهزة BD</td></tr></tbody></table>

قياس الكمي glut4 إزفاء إلى غشاء البلازما التي التدفق الخلوي

Quantitative Measurement of GLUT4 Translocation to the Plasma Membrane by Flow Cytometry

الجلوكوز هو المصدر الرئيسي للطاقة في الجسم ، الأمر الذي يتطلب التنظيم المستمر لتركيز الدم والخمسين. الافراج عن الانسولين من البنكرياس يدفع امتصاص الغلوكوز من قبل الأنسجة الحساسة للأنسولين ، وعلى الأخص في الدماغ ، والعضلات والهيكل العظمي والخلايا الشحمية. المرضى الذين يعانون من مرض السكري نوع 2 و / أو السمنة غالبا ما تضع مقاومة الانسولين وغير قادرة على السيطرة على توازن الجلوكوز. وقد رؤى جديدة في آليات مقاومة الانسولين تقديم استراتيجيات جديدة لمعالجة مرض السكري من نوع 2. الأسرة تخمة من ناقلات الجلوكوز يتكون من ثلاثة عشر عضوا موزعة على الأنسجة المختلفة في جميع أنحاء الجسم 1. اكتب نقل الجلوكوز 4 (GLUT4) هو نقل الكبرى التي تتوسط امتصاص الأنسولين الجلوكوز الأنسجة الحساسة ، مثل العضلات والهيكل العظمي. عند الربط من الانسولين لمستقبله ، التي تحتوي على حويصلات GLUT4 نقل من مكان لآخر من السيتوبلازم إلى غشاء البلازما ، وحمل امتصاص الغلوكوز. انخفاض GLUT4 إزفاء هي واحدة من أسباب مقاومة الانسولين في مرض السكري من نوع 2 2،3. يمكن للإزفاء من GLUT4 من السيتوبلازم إلى غشاء البلازما التي يمكن تصور كيمياء سيتولوجية مناعية ، وذلك باستخدام fluorophore - مترافق GLUT4 محددة الأجسام المضادة. هنا ، نحن تصف تقنية لتحديد مجموع المبالغ من GLUT4 إزفاء إلى غشاء البلازما الخلايا خلال مدة المختار ، وذلك باستخدام التدفق الخلوي. هذا البروتوكول هو السريع (أقل من 4 ساعات ، بما في ذلك الحضانة مع الأنسولين) ويسمح تحليل بعض الخلايا مثل 3000 أو ما يصل إلى 1000000 في حالة الخلايا في تجربة واحدة. لأنه يعتمد على مكافحة GLUT4 الأجسام المضادة الموجهة إلى حاتمة الخارجية للنقل التي تربط إليها بأسرع ما يتعرض له المتوسط ​​خارج الخلية بعد إزفاء إلى غشاء البلازما.

يصف هذا البروتوكول تقنية سريعة لقياس إزفاء من GLUT4 من السيتوبلازم إلى غشاء البلازما من الخلايا التدفق الخلوي.

قياس الكمي GLUT4 إزفاء إلى غشاء البلازما التي التدفق الخلوي

يعد الجلوكوز المصدر الرئيسي للطاقة في الجسم، مما يتطلب تنظيماً مستمراً لتركيزه في الدم. ويحفز إفراز الإنسولين من قبل البنكرياس ...

الهدف العام من هذا الإجراء هو الكشف عن انتقال GLUT4 إلى الغشاء البلازمي لخلايا الثدييات استجابةً للتعرض للإنسولين. يتم أولاً زراعة أرومات عضلية مجوعة المصل، والتي لا تمتلك سوى بروتين GLUT4 داخل الحويصلات، في طبق زراعة ذي 24 بئراً. ثم يُضاف إلى الخلايا جسم مضاد ضد حاتمة خارجية لـ GLUT4، يكون قد تم تحضينه مسبقاً مع جسم مضاد ثانوي مقترن بفلور، يليه إضافة الإنسولين.يؤدي ارتباط مستقبلات الإنسولين على سطح الخلايا إلى انتقال GLUT4 إلى سطح الغشاء البلازمي. بعد ذلك، يتم التعرف على GLUT4 بواسطة الأجسام المضادة الموجودة في الوسط. وفي هذه المرحلة، يمكن تثبيت الخلايا وقياس شدة الصبغ الفلوري باستخدام قياس التدفق الخلوي.يمكن استخدام هذه الطريقة لدراسة انتقال ggl four وأيض الجلوكوز، كما يمكن تطبيقها على أنظمة أخرى مثل إخراج حبيبات الخلايا القاتلة الطبيعية (NK cell) من خلال كشف CD 1 0 7 A عند الغشاء. وبالنسبة لهذا الإجراء، من المهم استخدام خلايا في حالة نمو نشط أو بنسبة تلاحم تبلغ 60 إلى 80%، وأن تكون قد خضعت للتجويع من المصل طوال الليل. بعد حصاد الخلايا باستخدام التربسين، اغسلها وأعد تعليقها في وسط نمو عادي بتركيز 200, 000 خلية لكل ملليلتر، ثم وزع الخلايا في طبق ذي 24 بئراً بمعدل 0.1 مليون خلية لكل 500 microliters في البئر الواحد. بعد ذلك، حضن الخلايا لمدة ساعة واحدة عند 37 °C للسماح للخلايا بالتعافي من تأثير التربسين.وفي هذه الأثناء، اخلط الجسم المضاد الأولي anti-gliadin 4 والجسم المضاد الثانوي chicken anti-goat IgG المقترن بـ Alexa Fluor 488 بنسبة 5 إلى 1، واحسب الحجم النهائي المطلوب، مع مراعاة استخدام 10 µL من خليط الأجسام المضادة لكل بئر. حضّن خليط الأجسام المضادة لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة وفي الظلام، وأثناء فترة تحضين خليط الأجسام المضادة، قم بتحضير مخزون عمل بتركيز مضاعف مرتين من الأنسولين عن طريق تخفيفه إلى التركيز المطلوب في وسط النمو.بمجردما تكتمل فترة تحضين الخلايا لمدة ساعة واحدة، أخرجها من المحضنة. أضف بلطف 10 µL من محلول الأجسام المضادة إلى كل بئر يحتوي على خلايا. تأكد من ترك بئر واحد على الأقل بدون صبغ.ستُستخدم هذه العينة السالبة لاحقاً لضبط جهاز قياس التدفق الخلوي. بعد ذلك، أضف 500 µL من المخزون المركز من الإنسولين بتركيز ضعفين إلى كل بئر لتحفيز انتقال GLUT4 إلى سطح الخلية، ثم حضن الطبق لمدة 30 دقيقة عند 37 °C في الظلام. بعد إخراج الخلايا من الحضانة، قم بتثبيتها بإضافة 1 mL من PBS 1%PFA إلى كل بئر وحضن الطبق لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة في الظلام. باستخدام رافع الخلايا، افصل الخلايا المثبتة بلطف من قاع الآبار وانقلها من كل بئر إلى أنبوب FACS منفصل.قم بطرد الأنابيب مركزياً لترسيب الخلايا، ثم استخدم جهاز هزاز Vortex وأعد تعليقها في 1 mL من PBS لغسل الخلايا وطردها مركزياً مرة أخرى، وكرر عملية الغسل هذه مرتين، مع التخلص من السائل الطافي بين عمليات الغسل.أخيراً، أعد تعليق الخلايا المغسولة في 400 microliters من PBS 1%PFA. يمكن الآن تحليل الخلايا للكشف عن التعبير السطحي لـ glute four باستخدام جهاز قياس التدفق الخلوي. وبمجرد وصولك إلى جهاز قياس التدفق الخلوي مع عيناتك، ابدأ في الحصول على البيانات من العينة الضابطة غير المصبوغة.حدِّد بوابة واسعة للخلايا الحية باستخدام معلمات التشتت الأمامي والجانبي. ثم اضبط إعداد الجهد لقناة FL one بحيث تكون الذروة السالبة مرئية ضمن هوامش المخطط التكراري. بمجرد ضبط هذه المعلمات، قم بتشغيل كل عينة تجريبية مع تسجيل ما لا يقل عن 10,000 حدث حي لكل أنبوب.يُظهر هذا المدرج التكراري زيادة تنظيم صبغ Glut4 السطحي في الخلايا العضلية التي تعرضت لـ 0 أو 1 أو 10 أو 100 nanomolar من الإنسولين. وفي المقابل، تفشل الخلايا العضلية المأخوذة من أفراد يعانون من مقاومة الإنسولين في زيادة تنظيم Glut4 استجابةً لـ 100 nanomolar من الإنسولين. وإذا تم تطبيع متوسط شدة الفلورية للخلايا المحفزة بالنسبة للخلايا غير المحفزة، يصبح من الممكن مقارنة قيم MFI للخلايا العضلية السليمة وتلك المقاومة للإنسولين بشكل مباشر.باستخدام هذا الإجراء، يمكن صبغ الخلايا بعلامات إضافية سطحية أو داخل خلوية لتحديد المجموعات الفرعية المختلفة من الخلايا في المجتمعات الخلوية المختلطة.

quantitative-measurement-glut4-translocation-to-plasma-membrane-flow

Research

JoVE Journal

Biology

علم الأحياء

يوضح هذا الفيديو قياس التدفق الخلوي لقياس امتصاص الخلايا الدبقية الدقيقة للجسيمات الحيوية الفلورية بعد الولادة داخل الجسم الزجاجي في عين الفأر. يكتشف قياس التدفق الخلوي الخلايا الحية التي تعبر عن CD11b ويميز الخلايا الدبقية الصغيرة البلعمية التي تظهر مضان أخضر عن الخلايا النخاعية الأخرى ، بما في ذلك الخلايا الوحيدة التي تعبر عن Ly6C والعدلات التي تعبر عن Ly6G.

قياس امتصاص الخلايا الدبقية الصغيرة لجزيئات الفلورسنت التي يتم تسليمها داخل الجسم الزجاجي باستخدام قياس التدفق الخلوي

هذه المادة سوف تظهر كيفية رصد ديناميات الجلوتامين في الخلايا الحية باستخدام الحنق. أجهزة الاستشعار المرمزة وراثيا يسمح مراقبة الوقت الحقيقي من الجزيئات البيولوجية في قرار التحت خلوية. التصميم التجريبي والتفاصيل الفنية للإعدادات التجريبية، واعتبارات لتحليلات ما بعد التجريبية وسوف تناقش لأجهزة الاستشعار الجلوتامين المشفرة وراثيا.

الجلوتامين الجريان التصوير باستخدام مجسات مشفرة وراثيا

الخلايا الوحيدة هي مكونات لا يتجزأ من الجهاز المناعي الفطري البشري الذي يعتمد على التمثيل الغذائي للسكر عند تنشيطه. نصف بروتوكول قياس التدفق الخلوي لقياس التعبير عن ناقل الجلوكوز وامتصاص الجلوكوز بواسطة الخلايا الوحيدة الكلية والمجموعات السكانية الوحيدة في الدم الكامل الطازج.

وتدفق Cytometric بسيط طريقة لقياس امتصاص الغلوكوز والجلوكوز التعبير الناقل للالقطعان الوحيدات في الدم الكامل

يصف هذا البروتوكول طريقة لقياس بحساسية معدل النقل نوكلوسيتوبلاسميك داخل الخلايا العصبية الحركية مثل نسك-34 الخلايا عن طريق قياس التغير في الوقت الحقيقي في استيراد النووي للبروتين نلس-نيس-غفب.

فحص لقياس نوكلوسيتوبلاسميك النقل في الوقت الحقيقي داخل موتور الخلايا العصبية مثل نسك-34 الخلايا

تقدم هذه المقالة طريقة لدراسة مستقبلات الغلوتامات (GluR) الاتجار في الثقافات فرس النهر الأولية المنفصلة. باستخدام نهج تغذية الأجسام المضادة لتسمية مستقبلات ذاتية أو مبالغ فيها في تركيبة مع النهج الدوائية، وهذا الأسلوب يسمح لتحديد الآليات الجزيئية التي تنظم التعبير سطح غلور عن طريق تحوير عمليات الاستيعاب الداخلي أو إعادة التدوير.

نهج تغذية الأجسام المضادة لدراسة الاتجار بمستقبلات الغلوتامات في ثقافات فرس النهر الأولية المنفصلة

يتم زيادة امتصاص الجلوكوز في الخلايا العصبية الحركية Drosophila المتضررة من بروتين تار ملزمة الحمض النووي (TDP-43) اعتلال البروتين، كما هو مبين من قبل FRET القائم، ومستشعر الجلوكوز المشفرة وراثيا.

قياس امتصاص الجلوكوز في نماذج Drosophila من اعتلال البروتين TDP-43

يصف هذا العمل بروتوكولا للقياس الكمي لتعديلات الهستون العالمية باستخدام قياس التدفق الخلوي داخل النواة في الخلايا الدبقية الصغيرة المعزولة في الدماغ. يحتوي العمل أيضا على بروتوكول عزل الخلايا الدبقية الصغيرة الذي تم استخدامه لجمع البيانات.

القياس الكمي لتعديلات هيستون العالمية بعد الترجمة باستخدام قياس التدفق الخلوي داخل النواة في الخلايا الدبقية الصغيرة لدماغ الفأر المعزول

نقدم هنا بروتوكولين لتحديد ابتلاع الخلايا الدبقية الصغيرة للمشابك العصبية الإيجابية vGLUT1 والمشابك العصبية الخام ذات العلامات الحمراء pHRodo باستخدام قياس التدفق الخلوي.

القياس الكمي للابتلاع الدبقي الصغير للمواد المتشابكة باستخدام قياس التدفق الخلوي

الإلتقام ينظم ينظم مستويات التعبير سطح الخلية لمعظم البروتينات الغشاء. هنا نستخدم اختزال والكواشف غشاء biotinylation impermeant لقياس معدل التقامي للنقل الدوبامين (DAT) ، وهو بروتين الغشاء polytopic. الأسلوب يسهل نهج مباشرة لقياس معدل التقامي معظم البروتينات غشاء البلازما.

قياس معدلات بلازما بروتين الغشاء التقامي بواسطة Biotinylation عكسية

ويقدم الأسلوب IP - FCM ، الذي يسمح للقوي وحساسة ، وتقييم من التفاعلات الكيميائية الحيوية البروتين البروتين الأصلي ، دون الحاجة إلى الهندسة الوراثية أو أحجام عينة كبيرة.

IP - FCM : مناعي التي كشفتها التدفق الخلوي

تعلم قياس انتقال GLUT4 إلى غشاء البلازما باستخدام تقنية التدفق الخلوي في خلايا العضلات. تساعد هذه الطريقة الباحثين على دراسة استجابة الجلوكوز للأنسولين واضطرابات التمثيل الغذائي.

قياس الكمي GLUT4 إزفاء إلى غشاء البلازما التي التدفق الخلوي

استكشف المزيد من الفيديوهات