씬 크로마 토그래피 (TLC)에 의해 Arabidopsis thaliana 폴라 Glycerolipid의 프로파일은 기체 - 액체 크로마 토그래피 (GLC)와 결합

이 절차의 전반적인 목표는 애기장대 묘목의 극성 지질 조성을 측정하는 것입니다. 이것은 먼저 묘목에서 지질을 추출하여 수행됩니다. 그런 다음 극성 지질은 박층 크로마토그래피로 분리됩니다.

다음으로 특정 지질 반점은 박층 플레이트에서 분리되어 에스테르 교환에 의해 지방 아살 메틸 에스테르로 전환됩니다. 절차의 마지막 단계는 기체 액체 크로마토그래피로 지방 아살 메틸 에스테르의 조성을 정량화하는 것입니다. 궁극적으로, 야생형 및 돌연변이에서 각 극성 지질의 몰 비율과 지방산 프로파일을 보여주는 결과를 얻을 수 있습니다.

안녕하세요, 제 이름은 크리스토프 베닝입니다. 많은 분들이 극성 지질의 정량 분석을 수행하는 방법에 대해 문의해 주셨습니다. 우리는 매우 간단하고 강력한 방법을 사용하여 모델 플랜트 옵시스 또는 RG 킬로미터 모터에서 돌연변이를 대규모로 스크리닝하는 데 효과적이었습니다.

질량 분석 기반 지질 프로파일링과 같은 다른 우수한 방법에는 고가의 장비와 많은 경험 및 교육이 필요합니다. 당사는 돌연변이 분리 후 지방산 메틸 에스테르의 정량화와 결합된 간단한 박막 크로마토그래피를 포함하는 2단계 절차를 사용합니다. 일반적으로 보다 정량적인 분석이 필요합니다.

이는 박막 플레이트에서 막 지질을 분리하고 지방산 메틸 에스테르를 준비하여 수행되며, 이는 액체 가스 크로마토그래피로 정량화됩니다. 이 방법은 재현성이 높으며 결과가 더 복잡한 질량 분석 기반 기술과 비교할 수 있음을 입증하는 것은 Zen Wang, 내 실험실의 대학원생이 아가, 응고된 배지 또는 토양에서 자란 식물에서 4주 된 애기장대 잎 30mg을 수확하여 지질 추출을 시작합니다. 잎을 1.5ml 프로필렌 반응 튜브로 옮깁니다.

각 샘플에 메탄올, 클로로포름 및 포름산으로 구성된 추출 용매 300마이크로리터를 추가합니다. 샘플을 5분 동안 세게 흔듭니다. 다음으로, 150 마이크로리터의 0.2 몰 인산, 1 몰 염화 칼륨 및 와류를 추가합니다.

짧게 13, 1 분 동안 000 시간 G에 표본을 원심 분리하십시오. 실온에서 하부 클로로포름 상에 용해된 지질은 박층 크로마토그래피 플레이트에 발견됩니다. TLC 플레이트를 준비하기 위해 20 x 20cm 실리카겔 코팅된 TLC 플레이트를 로딩 스트립으로 0.15 몰 황산암모늄 용액에 담그십시오.

30초 동안 담근 후 뚜껑이 있는 용기에서 접시를 최소 2일 동안 건조시킵니다. 활성화하는 동안 암모늄의 승화는 다른 글리세롤 지질로부터 분리하는 데 필요한 프로톤산 인산염 ar 글리세롤을 남기는 황산을 남깁니다. 실험 당일에는 TLC 플레이트를 섭씨 120도의 오븐에서 2시간 30분 동안 굽는 것으로 활성화합니다.

활성화된 플레이트를 실온으로 냉각한 후 연필을 사용하여 크로마토그램 원점에서 플레이트를 가로질러 직선을 그립니다. 흄 후드에서 질소 탱크의 조절기에 연결된 tigon 튜브는 질소 가스의 흐름을 제공하는 데 사용되며, 질소 가스의 느린 흐름 아래에서 200 마이크로 리터의 노란색 플라스틱 팁이있는 애완 동물 당 20 마이크로 리터를 사용하여 하부 클로로포름 상에서 20 마이크로 리터의 지질 추출물을 플레이트로 3 배 천천히 전달합니다. 반려견 한 마리당 20마이크로리터를 사용하여 지름이 1cm보다 작은 지점을 유지합니다.

각 플레이트는 지질 스팟이 완전히 건조됨에 따라 최대 10개의 샘플을 담을 수 있습니다. 흄 후드에서 아세톤, 톨루엔 및 물로 구성된 현상 용매를 준비합니다. 80ml의 현상 용매를 밀봉 가능한 TLC 현상 챔버에 붓고 플레이트를 탱크에 놓습니다.

샘플 끝이 아래를 향하게 하여 탱크를 밀봉합니다. 클램프를 사용하면 용매가 플레이트를 타고 올라가고 지질이 분리됩니다. 개발 시간은 실온에서 약 50분입니다.

솔벤트 전면이 플레이트 상단에서 1cm에 도달하면 탱크에서 플레이트를 조심스럽게 제거하고 흄 후드에서 플레이트를 10분 동안 완전히 건조시킵니다. TLC에 의해 분리된 지질은 정량 분석을 위해 요오드로 잠시 가역적으로 염색하거나 황산 또는 알파 나탈로 비가역적으로 염색할 수 있습니다. 돌이킬 수 없게 하려면 황산 탄화를 통해 플레이트를 더럽히십시오.

흄 후드의 유리 스프레이 병에 50% 황산을 물에 담아 플레이트에 스프레이하고 섭씨 120도에서 15분 동안 굽습니다. 반대로, 당지질에 대한 알파 출생 염색 때, 플레이트에 2.4 % 무게 오버 볼륨 알파 나탈 10 % 볼륨, 황산, 80 % 볼륨 오버 볼륨으로 플레이트를 스프레이 합니다. 에탄올은 섭씨 120도에서 당지질 반점이 분홍색 또는 보라색으로 변할 때까지 3-5분 동안 접시를 굽습니다.

요오드 염색 수행 흄 후드에서 탱크 바닥의 트레이에 요오드 결정이 있는 밀폐된 LC 탱크를 준비하여 요오드 증기로 대기를 포화시킵니다. TLC 플레이트를 탱크에 넣어 지질이 보일 때까지 요오드에 노출시킵니다. 요오드가 공유 작용할 수 있으므로 요오드를 너무 오래 노출시키지 마십시오.

고도 불포화 지방산을 수정합니다. 면도날로 TLC 플레이트에서 식별된 지질 반점을 둘러싼 실리카를 제거하고 실리카가 함유된 지질을 긁어냅니다. 깔때기를 사용하여 실리카 분말을 테프론 라인 나사 캡이 있는 유리관으로 옮깁니다.

무수 메탄올에 1 밀리리터의 염산을 첨가하십시오.amp유리 peppe로 각 샘플에. 그런 다음 200 마이크로 리터의 노란색 플라스틱 팁이있는 애완 동물 당 200 마이크로 리터를 사용하여 각 샘플에 밀리리터 페네데스 산당 50 마이크로 그램의 100 마이크로 리터를 추가합니다. 또한 methodol 염산에 펜트 데칸산만 있는 튜브를 대조군으로 준비합니다.

테프론을 깐 캡으로 유리관을 단단히 닫습니다.유리관을 섭씨 80도의 수조에서 25분 동안 배양합니다. 튜브는 튜브가 냉각된 후 용매가 증발하지 않도록 밀봉해야 합니다.

0.9% 염화나트륨 1밀리리터와 헥산 1밀리리터를 첨가한 다음 원심분리 후 3분 동안 1000배 G로 샘플을 격렬하게 원심분리하고 흄 후드에서 파스타 페페로 샘플의 헥산 상층을 제거하고 새로운 13 x 100mm 유리관에 넣습니다. 건조하지 않고 느린 질소 흐름으로 헥산을 증발시키고 생성된 지방 비염 메틸 에스테르를 60마이크로리터의 헥산에 완전히 용해시킵니다. 샘플을 자동 샘플러 바이알로 옮긴 다음 단단히 뚜껑을 닫습니다.

샘플은 단기적으로 섭씨 4도에서 보관할 수 있으며 시작하기 전에 며칠 동안 섭씨 영하 20도에서 보관할 수 있습니다. GLC. 헬륨, 수소 및 공기 병이 채워져 있는지 확인하고, 용매 저장소에 충분한 헥산을 추가해야 하며, 지방 아살 메틸 레스터 분리를 위해 폐기물 용기를 비워야 합니다. DB 23 열을 시스템에 연결합니다.

바이알을 자동 샘플러에 놓습니다. 시스템에서 GLC용 화학 스테이션 소프트웨어를 시작합니다. 컴퓨터. 입구 온도를 섭씨 250도, 헬륨 유량은 분당 48.6밀리리터, 압력은 21.93PSI로 설정합니다.

분할 비율은 30 대 1입니다. 오븐 온도는 처음에 섭씨 140도에서 2분 동안 설정되고 분당 섭씨 25도의 속도로 섭씨 160도까지 올라갑니다. 그런 다음 온도를 섭씨 160도에서 섭씨 250도까지 분당 8도의 비율로 높이도록 설정하고, 온도를 4분 동안 섭씨 250도로 유지한 다음 분당 섭씨 38도의 속도로 섭씨 140도로 낮추도록 설정합니다.

이 온도 프로파일을 사용하면 한 번 실행하는 데 약 21분이 걸립니다. 화염 이온화 감지기의 온도는 섭씨 270도이며 수소 유속은 분당 30밀리리터입니다. 분당 400밀리리터의 공기 흐름 속도와 분당 30밀리리터의 헬륨 유량.

바이알의 수와 샘플 이름을 run sequence 테이블에 입력합니다. 10마이크로리터 주입기를 설정하여 바이알당 2마이크로리터의 샘플을 주입합니다. 기기가 준비되면 실행 시퀀스를 시작합니다.

4주 된 애기장대 묘목에서 TLC로 분리된 지질의 염색 예가 여기에 나와 있습니다. 황산으로 염색된 지질은 탄화되어 갈색 반점으로 나타납니다. 알파 나탈은 M-G-D-G-D-G-D-G 및 SQ dg와 같은 당지질을 염색하는 데 선호됩니다.

알파 출생으로 염색된 당지질은 분홍색, 자주색을 띠는 반면 다른 극성 지질은 노란색으로 염색됩니다. 요오드 염색은 되돌릴 수 있으며 지질에 황색을 띠게 하며 요오드가 증발함에 따라 짧은 시간 동안 사라집니다. 간단히 말해서, 요오드 염색 지질은 GLC 분석을 수행할 수 있지만, 성공적으로 수행될 경우 염색되지 않은 지질이 지질 분해를 줄이는 것이 바람직합니다.

탄소 사슬이 더 짧고 이중 결합이 적은 GLC 지방 비살 메틸 에스테르가 더 짧은 체류 시간을 가진 후에 다른 지방 비살 메틸 레스터를 나타내는 독특한 신호가 관찰될 것입니다. DB 23 열을 사용합니다. Fatty assal methyl ester 프로파일링은 지질 구성이 변경된 돌연변이를 식별하기 위한 민감한 도구입니다.

MGDG 18 3 지방산 몰 비율은 지방 assal 메틸 에스테르의 몰을 지방 assal methyl eta의 몰과 함께 하나의 지질 등급으로 나누어 야생형에 비해 TGD 4 dash 1 돌연변이에서 감소됩니다. 모든 지질 등급 중에서, 각 지질의 몰 비율은 야생형과 돌연변이 모두로부터 각 지질 등급의 결과 몰 비율이 여기에서 비교될 수 있습니다. TGD four dash one 돌연변이체는 MGDG와 pg의 상대적인 양을 증가시켰지만 D-G-D-G-N-P-E 박층 크로마토그래피의 양이 감소하여 많은 샘플을 병렬로 검사할 수 있으며 지질 프로필의 주요 차이를 육안으로 검사할 수 있습니다.

또한, TLC를 보면 본질적으로 지질의 합성에 필요한 많은 효소와 유전자를 검사하고 있으므로 지질 프로파일을 검사하고 있습니다. 이 동영상을 시청한 후에는 TOC 및 GOC별로 극성 지질의 조성을 분석하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 비디오를 시청해 주셔서 감사드리며 실험에 행운을 빕니다.