الإدارة السلبي من الاجسام المضادة ضد H. المغمدة مسببات الأمراض الفطرية وآخرون

الهدف العام من هذا الإجراء هو تعزيز قدرتنا على حماية الأفراد بالأجسام المضادة أو اللقاحات للوقاية من داء النوسجات أو علاجه ، وفحص دور عوامل الفوعة في التسبب في المرض. يتم تحقيق ذلك عن طريق عزل وتوصيف الأجسام المضادة وحيدة النسيلة أولا لاستهداف المستضدات. تتمثل الخطوة الثانية من الإجراء في إعطاء الأجسام المضادة وحيدة النسيلة المختارة ، داخل الصفاق قبل ساعتين من العدوى داخل الأنف.

من أجل أن يكون لهذه الجزيئات وقت للتوزيع في جميع أنحاء الجسم ، فإن الخطوة الثالثة من الإجراء هي تخدير الفئران وإصابتها باللقاح المطلوب عن طريق الأنف. الخطوة الأخيرة من الإجراء هي مراقبة صحة. يتم قتل إما على فترات مختلفة لتحديد الأعباء الفطرية وتقييم الاستجابات الالتهابية أو يتم متابعتها للبقاء على قيد الحياة.

في النهاية ، يمكن الحصول على نتائج تظهر إطالة البقاء على قيد الحياة وتعديل الاستجابات المرضية في الأعضاء المصابة بالفئران المصابة بالمرض المميت من خلال الإدارة البريتونية للأجسام المضادة وحيدة النسيلة الواقية قبل الإصابة ، سيكون إثبات الإجراء هو حليف إيمر ، طالب ما بعد الدكتوراه يتمتع بخبرة واسعة في التسبب في الفطريات ونماذج العدوى الحيوانية. الميزة الرئيسية لهذه التقنية على الطرق الحالية مثل الأدوية المضادة للفطريات ، هي أن الأجسام المضادة وحيدة النسيلة هي جزيئات ذات خصائص ictal تعمل من خلال إشراك عامل المضيف المحتمل. الاستجابة للمرض العرض البصري لهذه الطريقة أمر بالغ الأهمية.

كإعطاء الأجسام المضادة أحادية النسيلة وخطوات العدوى داخل الأنف يصعب تعلمها لأنها تتطلب خبرة في التعامل مع. قم بإعداد خزانة من المستوى الثاني للسلامة الحيوية للعمل مع الفطريات في شكل خميرة عن طريق تنظيف الخزانة بالمبيض ، متبوعا بالأشعة فوق البنفسجية. قم بإعداد أنبوب مخروطي سعة 15 مليلتر مع خمسة ملليلتر من PBS.

احصد مستعمرة من H caps AUM من كمية من المخزون ، مجمدة عند 80 درجة مئوية تحت الصفر ، وأضفها إلى دوامة PBS. الخلايا بقوة وأجهزة الطرد المركزي ل 1100 مرة ، ز لمدة 10 دقائق. في درجة حرارة الغرفة ، قم بإزالة المادة الطافية بعناية دون إزعاج الحبيبات وأضف ما لا يقل عن 10 مل من PBS الطازج.

كرر هذا الإجراء ثلاث مرات بعد الغسيل النهائي. إعادة تعليق الخلايا في خمسة ملليلتر من PBS. يجب أن تتم جميع عمليات الغسيل في درجة حرارة الغرفة لتعطيل الخلايا المجمعة ، قم بتمرير خلية الخميرة عبر نصف إبرة قياس 26 باستخدام حقنة سعة 10 مليلتر خمس مرات لجمع خلايا الخميرة في أنبوب مخروطي سعة 50 ملليلترا.

لعزل الخميرة الصغيرة ذات الحجم الموحد ، قم بالطرد المركزي للخلايا عند 55 مرة G لمدة دقيقة واحدة ، ثم قم بإزالة المليلتر العلوي. أضف تعليق الخلية إلى قارورة زجاجية معقمة سعة 250 مليلتر تحتوي على 100 مل من لحم الخنزير ، F 12 وسط ، ثم قم بزراعة الخلايا عند 37 درجة مئوية لمدة 48 ساعة في حاضنة مع الاهتزاز بتركيز ثاني أكسيد الكربون في الغرفة. سيتم استخدام هذه الثقافة لتحضير اللقاح وسيتم تقييم فعالية الأجسام المضادة وحيدة النسيلة المتولدة في الخطوة التالية.

قم بزراعة الأورام الهجينة المختارة في DMEM بعد خمسة إلى سبعة أيام. الحضانة ، حصاد الأجسام المضادة عن طريق جمع جميع الوسائط من قارورة زراعة الخلية ثم الطرد المركزي للوسط عند 1100 مرة G لمدة 10 دقائق. كما هو الحال مع خلايا الخميرة ، يمكن غسل الأجسام المضادة في درجة حرارة الغرفة.

اجمع المادة الطافية دون تعطيل الكريات. بعد ذلك ، قم بتنقية المادة الطافية الخالية من الخلايا باستخدام راتنج البروتين AG عن طريق التقاط F-P-L-C-A. يستخدم Eli SA لحساب تركيز الجسم المضاد أحادي النسيلة لتحديد مقدار الجسم المضاد المنقى الذي يجب حقنه.

يؤدي داخل الصفاق الإعطاء داخل الصفاق للجسم المضاد للتحكم في النمط المتماثل PBS أو الجسم المضاد التجريبي كما هو موضح في البروتوكول المكتوب المصاحب. انتظر ساعتين بعد حقن الأجسام المضادة أحادية النسيلة ، قبل تخدير الفأر والمضي قدما في العدوى داخل الأنف خلال فترة الانتظار. قم بإعداد أغطية النوسجات ، لقاح اللوتوم كما هو موضح في البروتوكول المكتوب المصاحب ، وقم بتجميع جهاز الخيط لإصابة الفأر عن طريق ربط خيط من النايلون أو القطن بإحكام بين حاملين من العمود ثم فصل الحوامل بحيث يكون الخيط تاو.

التخدير كيتامين بمعدل 100 ملليغرام لكل كيلوغرام وزيلازين بمعدل 10 ملليغرام لكل كيلوغرام. يمكن أيضا تحضيرها في هذا الوقت عندما يتم منح الأجسام المضادة متسعا من الوقت للتشتت. تخدير الفأر وتأكيد التخدير بسبب عدم الاستجابة لإصبع القدم.

قرصة بالملاقط. قم بتعليق الماوس برفق من أسنانه الأمامية على الخيط. قم بإعطاء ما يقرب من 50 ميكرولترا من اللقاح ببطء في الهواء باستخدام ماصة دقيقة.

مع مراقبة معدل تنفس الفأر عن كثب. اسمح للفأر بالراحة في هذا الوضع لمدة دقيقتين إلى خمس دقائق بعد الإصابة بالعدوى داخل الأنف لتسهيل ترسب الخميرة في رئتي بعد إصابة الفأر. حافظ على الماوس في بيئة دافئة ومراقبة بعناية باستخدام مصباح حراري إذا لزم الأمر حتى يتعافى من التخدير.

عندما يستيقظ الفأر ، أعده إلى قفص نظيف. مع الرغبة الجنسية ، يقيم الوصول إلى الغذاء والماء المصابة المصابة سريريا. لتحسين خمول تسرع التنفس وفقدان الوزن ، يجب فحص مرتين يوميا من قبل أعضاء المختبر ويوميا من قبل القائمين على رعاية.

مع داء النوسجات المورني حتى قرب نهاية الحياة ، لا توجد عادة علامات واضحة للعدوى بخلاف الزيادة الطفيفة في معدل التنفس. مع المرض المتقدم, يصبح الفئران بشكل ملحوظ إلى kyp ويكون لديه نشاط متناقص. عادة ما تصبح بسرعة أكثر وفرة وتنتهي صلاحيتها.

يجب القتل الرحيم للحيوانات المضطربة بشكل مناسب بثاني أكسيد الكربون. في غرفة مخصصة. يجب تعداد الوفاة المؤكدة بسبب عدم وجود استجابة انعكاسية لإصبع القدم ، قرصة للحيوانات المتوقفة يوميا.

قم بإعداد أنابيب مخروطية سعة 15 ملليلتر مع 10 ملليلتر من PBS لكل عضو يتم جمعه. القتل الرحيم للحيوانات المصابة باللقاح شبه المميت خمس مرات 10 إلى السادسة. تقوم خلايا الخميرة كما هو موضح سابقا ، وإزالة الرئتين والطحال والكبد على الفور بإعداد أنابيب مخروطية سعة 50 مليلتر مع خمسة ملليلتر من PBS.

قم بتركيب طبق بتري مع مصافي خلية 70 ميكرون لكل عضو ليتم تجانسه. نقع كل عضو على حدة مع خمسة ملليلتر الغطاسات ونقل إلى أنابيب 50 ملليلتر. بعد ذلك ، قم بتخفيف العضو بشكل متسلسل في ثلاثة تخفيفات عند واحد إلى 100 ، وواحد إلى 1001 إلى 5 ، 000 ولوحة 100 ميكرولتر على BHI.

تحتضن صفائح مثقب الدم الصفائح عند 37 درجة مئوية في حاضنة مع نسبة غرفة طبيعية من ثاني أكسيد الكربون لمدة تصل إلى 14 يوما وتعدد الجسم المضاد أحادي النسيلة CFUs. يعد النمط المتماثل أمرا بالغ الأهمية في الحماية ضد hcaps Lotum حيث أن الفئران التي عولجت ب IgG واحد أو IgG اثنين من الأجسام المضادة وحيدة النسيلة ل HS P 60 لديها بقاء طويل الأمد بشكل ملحوظ مقارنة بالفئران الضابطة التي تتلقى جسما مضادا أحادي النسيلة IgG two B إلى HSP 60 أو إما جسما مضادا أحادي النسيلة للتحكم في النمط المتماثل أو PS. علاوة على ذلك ، في الفئران التي تلقت أجساما مضادة وحيدة النسيلة الواقية ، كان هناك انخفاض كبير في عدد CFUs الرئوية والطحالية في اليوم السابع وانخفاض بمقدار اثنين و 2.5 وحدة لوغاريتمية من أعداد الخميرة في الرئتين في اليوم 14. باتباع هذا الإجراء ، يمكن إجراء طرق أخرى مثل تحديد العبء القشح الذي يدل على وحدة تشكيل المستعمرة ، والسيتوكينات المشاركة في العدوى وتقييم الطوبولوجيا من أجل الإجابة على أسئلة إضافية مثل تحديد آلية عمل تعديل المرض بواسطة الأجسام المضادة أثناء محاولة هذا الإجراء.

من المهم أن تتذكر العمل في ظروف السلامة البيولوجية أثناء التعامل مع الضربة والعمل وفقا للوائح رعاية للالتهابات الأنفية.