Name: 一个简单的方法来衡量在果蝇的乙醇灵敏度 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-02-19T17:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 15 s
Description: 学习使用果蝇乙醇敏感性测定法来评估Drosophila melanogaster的镇静反应。该方法通过测量翻正反射丧失来量化酒精敏感性差异，并可研究耐受性发展。

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感谢 Aylin Rodan 对手稿的审阅，以及实验室成员的有益讨论。本研究由美国国立卫生研究院（NIH）R01AA019526 项目资助。

1. 构建暴露室
<ol>
<li>使用剃刀刀片将一个瓶塞切成两半。或者，使用棉球。</li>
<li>将瓶塞的一半或棉球推入食物瓶底部，形成一个光滑的表面，防止果蝇被困住。</li>
<li>如果制备多个暴露室，请确保每个室中瓶塞和食物所占体积相同。可在瓶壁上做标记以方便操作。</li>
</ol>
2. 暴露果蝇
<ol>
<li>在暴露前一天，将8只同性别、日龄为1-5天的果蝇收集到不含酵母的普通食物试管中。</li>
<li>使用代码标记，使实验操作者对所用的实际基因型/品系保持盲态。</li>
<li>通过轻弹将8只果蝇转移至暴露装置中。切勿麻醉果蝇。</li>
<li>向纯乙醇（200 proof ethanol）中加入少量食用染料，例如酸性蓝9（acid blue 9），以便于观察。</li>
<li>用0.5 ml乙醇涂抹在试管塞底部或棉球上。</li>
<li>将含乙醇的塞子插入暴露试管中，确保乙醇面朝向试管内部，而非试管壁方向。</li>
<li>启动计时器，开始累计计时。</li>
</ol>
3. 记录乙醇诱导的中毒反应
<ol>
<li>计时开始后，每过一分钟，轻敲暴露室以惊动果蝇，并观察其十秒钟。</li>
<li>记录每分钟内静止不动的果蝇数量。若果蝇无法翻身、停留在原地不动，或在整个十秒观察期间持续快速振动翅膀，则视为静止状态。后者被视为静止，是因为绝大多数此类果蝇在快速振翅的间歇期间实际处于静止状态。若果蝇能够翻身并行走离开，或沿试管壁向上爬行，则不视为静止。</li>
<li>当记录到有4只或更多果蝇处于静止状态时，即结束一次暴露实验。</li>
<li>丢弃使用过的果蝇，并将暴露室通风，以备后续重复使用。</li>
</ol>
4. 确定达到50%镇静所需时间

50%果蝇发生镇静的时间（ST50）是指在乙醇暴露开始后，八只果蝇中有四只保持静止不动的时间点。该时间点按以下方法确定： 
或者：首次恰好有四只果蝇静止不动的测量分钟。 
或者：若在某一时间点（第X分钟）静止不动的果蝇少于四只（Y1），而在下一个测量时间点（第X+1分钟）静止不动的果蝇多于四只（Y2），则使用以下公式进行线性插值计算ST50： 
ST50 = (4 - Y1)/(Y2 - Y1) + X


5. 重复暴露以确定耐受性

暴露果蝇
<ol>
<li>测定实验中所用野生型对照品系的 ST50(wt)。</li>
<li>按照上述方法将实验组果蝇暴露于乙醇。</li>
<li>测定其 ST50(1)，但继续暴露至达到 2×ST50(wt) 的时间点。</li>
<li>将果蝇转移回空的食物小瓶中，静置 4 小时。</li>
<li>再次暴露果蝇，并测定第二次暴露的 ST50(2)。</li>
</ol>
确定耐受性
以 (ST50(2)/ ST50(1) - 1)×100 计算耐受性的百分比。

6. 代表性结果：
此处展示的是我们每种基因型和剂量使用6-8管果蝇获得的一些代表性结果。如果您的标准误差明显较大，则可能出现了系统性问题。请确保乙醇面向暴露室，并且各暴露室的体积相同。
 
<img src="/files/ftp_upload/2541/2541fig1.jpg" alt="按性别比较不同乙醇浓度下 ST50 时间的柱状图。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 1"> 
图 1. 野生型果蝇在不同浓度乙醇暴露下的剂量反应曲线。每种剂量和性别均使用八个试管的果蝇进行实验。雄性和雌性果蝇在各剂量下的 ST50 无显著差异（p&gt;0.22，双因素方差分析），而随着乙醇剂量的增加，不同剂量间的 ST50 显著降低（p&lt;0.001）。需注意，过于拥挤的培养瓶中的果蝇体型可能明显小于健康培养瓶中的个体，这种体型差异可能影响 ST50。为获得每瓶最佳的幼虫密度，建议每瓶接种 15–20 只雌蝇，产卵 1–2 天。
<img src="/files/ftp_upload/2541/2541fig2.jpg" alt="柱状图比较野生型和white rabbit在90%和100%乙醇浓度下的ST50值。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图2"> 
图2. 将果蝇暴露于90%或100%乙醇可重现此前报道的由white rabbit1突变2引起的乙醇抗性（p&lt;0.001，双因素方差分析）。
<img src="/files/ftp_upload/2541/2541fig3.jpg" alt="比较第一次和第二次暴露后（t+4小时）ST50时间的柱状图；数据分析结果。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图3"> 
图3. 间隔4小时恢复期的两次100%乙醇重复暴露，导致第二次暴露后ST50显著增加（p&lt;0.001，配对t检验）。注意，果蝇在第一次暴露时的处理时间为24分钟（相当于其初始ST50的两倍）。较短时间的暴露（12分钟）在再次暴露时未引起ST50的显著增加（数据未显示）。

<ol><li>Bainton, R. J., Tsai, L. T. -Y., Singh, C. S., Moore, M. S. Curr. Biol. 10, 187-194 (2000).</li>
<li>Rothenfluh, A., Threlkeld, R. J., Bainton, R. J., Tsai, L. T. -Y. Cell. 127, 199-211 (2006).</li>
<li>Devineni, A. V., Heberlein, U. Curr. Biol. 19, 2126-2132 (2009).</li>
<li>Scholz, H., Ramond, J., Singh, C. S., Heberlein, U. Neuron. 28, 261-271 (2000).</li>
<li>Allen, M. J., Godenschwege, T. A., Tanouye, M. A., Phelan, P. Semin. Cell Dev. Biol. 17, 31-41 (2006).</li>
<li>Feany, M. B., Bender, W. W. Nature. 404, 394-398 (2000).</li>
</ol>

无利益冲突声明。

在本演示中，我们概述了一种基于Bainton等（2000）1和Rothenfluh等（2006）2先前所描述方法的简单方案，用于测定乙醇诱导的中毒状态。由于酒精引起的镇静效应与饮酒偏好相关3，该实验方法对于研究酒精使用障碍具有重要意义。所述实验基于惊吓诱发的负向趋地性行为，以及酒精暴露对该先天行为反应的干扰作用。在开始暴露处理前，需确保所有果蝇对该惊吓刺激表现出正常反应，即：轻敲盛有果蝇的食物管使其沉降至管底后，在10秒观察时间内所有果蝇均应自底部向上移动。表现出负向趋地性减弱的果蝇实例包括对机械冲击敏感的癫痫突变体5，以及因多巴胺能神经元退化而导致运动能力缺陷的果蝇6。
尽管所述实验方法相对简单，但有两个变量需要特别注意，以确保结果的可重复性。首先，所有暴露小瓶的体积应保持一致。这包括确保小瓶底部的食物与瓶塞/棉球所占体积相同，以及将含乙醇的棉塞插入每个小瓶的深度保持一致。虽然该实验可使用完全空的小瓶，但这会导致ST50值延长，从而降低实验通量。
该实验方法也适用于测定果蝇在反复暴露于乙醇后所产生的耐受程度。进行反复暴露实验时，应考虑多个变量。首先，本实验中两次暴露之间的间隔时间为4小时。该变量可以调整，但我们建议间隔时间不应短于2小时，以确保第一次暴露中的乙醇得以充分清除。有关乙醇耐受形成与消退的动力学，请参见 Scholz 等人 20004。第二个需要考虑的变量是首次暴露的持续时间。显然，对照组和实验组果蝇的暴露时间必须相同。然而，这并不一定意味着两种果蝇品系实际摄入的乙醇量相同。被麻醉的果蝇比活跃的果蝇吸收更多的乙醇2，因此较早进入麻醉状态的品系可能比较晚麻醉的品系接受更高剂量的乙醇，从而因初始剂量较高而表现出更强的耐受性。因此，当比较在初始ST50(1)值上存在差异的果蝇品系时，我们强烈建议读者谨慎解读其耐受性发展结果。
本文所述的实验方法是一种简便且可重复地测定果蝇对酒精行为反应的有效工具。

<table><tbody><tr><td>暴露小瓶</td><td>www.flystuff.com</td><td>32-116</td><td></td></tr><tr><td>塞子</td><td>www.flystuff.com</td><td>49-102</td><td></td></tr><tr><td>酸性蓝 9</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>861146</td><td></td></tr></tbody></table>

一种测量果蝇乙醇敏感性的简便方法

A Simple Way to Measure Ethanol Sensitivity in Flies

低剂量乙醇会使果蝇变得过度活跃，而高剂量则具有镇静作用。特定品系果蝇对乙醇诱导镇静的敏感性与其对乙醇的偏好性相关，因此镇静效应是研究酒精反应和饮酒行为遗传机制的高度相关指标。我们展示了一种简单的方法，用于使果蝇接触乙醇并测量其醉酒效应。本实验方法可测定急性敏感性，以及重复暴露所诱导的乙醇耐受性。该方法无需复杂的技术设备，因此可在任何具备基本果蝇培养工具的实验室中应用。

本文描述了一种基于翻正反射消失来测量乙醇对Drosophila果蝇镇静作用的简单检测方法。

低剂量乙醇会使果蝇变得过度活跃，而高剂量则产生镇静作用。特定果蝇品系对乙醇诱导镇静的敏感性……

大家好，我是来自达拉斯市德克萨斯大学西南医学中心精神病学系Adrian Rothenfluh实验室的Thomas Maples。今天我将演示一种测定果蝇对乙醇诱导镇静敏感性的简单方法。该检测基于果蝇在接触乙醇后失去攀附反射和行走能力的现象。该方法可用于确定不同果蝇品系及突变体之间的酒精敏感性差异。我们还可以利用此检测方法诱导果蝇产生耐受性，即在反复暴露于酒精后，其反应性降低。现在开始操作。进行本实验时，您将需要以下小瓶。其中装有八只果蝇，这些果蝇应为您在一天或两天前采集的样本。您可以使用雄性或雌性果蝇进行暴露实验。然而，每个试剂瓶应仅包含一种性别。一个不含果蝇的空食物瓶、一把剃刀、两个由类似棉花的材料制成的瓶塞。如果您没有这种泡沫瓶塞，也可以使用棉球、带吸头的1000微升微量移液器、含有食用染料的纯度为200 proof的乙醇（可在任何杂货店购买）以及一个计时器。首先，我们需要制作一个暴露室，用于将果蝇暴露于乙醇环境中并监测其活动能力。制作该暴露室时，先用剃刀片将一个瓶塞切成两半，然后将其中一半推入小瓶底部，覆盖在培养基上。这将为果蝇提供一个平整且无黏性的行走表面。如果使用棉球，请将其平整地压紧，并尽可能使其不那么蓬松，以防止果蝇被棉纤维缠住。如果制备多个培养室，请确保每个培养室中的食物和试管塞所占空间相同。这确保了每个暴露室中的果蝇所接触的乙醇体积相同。经过练习，可以轻松地同时处理三管果蝇。一旦暴露室制备完成，我们即可开始对果蝇进行乙醇暴露处理。首先，将一个含有八只果蝇的小瓶转移至暴露室中，并用最初盛放果蝇的小瓶的塞子密封暴露室。接着，用移液器吸取500 µL你所选定浓度的染色乙醇，滴加到一个类似小瓶塞的棉质塞子的一端。然后，将暴露室的塞子替换为涂有乙醇的塞子，将涂有乙醇的一端插入暴露室内。将乙醇浸润的塞子加入暴露室后，立即启动计时器。乙醇中的染料有助于确保乙醇面朝向暴露室内部，而非朝向小瓶的管壁。这一点尤为重要，特别是当使用棉球而非专用泡沫塞时，因为棉球的任意一侧均可能朝向管内。在此暴露过程中，我们使用的是100%酒精，它正在扩散到暴露室中，果蝇通过空气吸入该物质。每次将涂有乙醇的塞子放入暴露室后，每隔一分钟，我们将统计有多少果蝇已变得静止不动，即无法翻身并行走。果蝇保持活动状态的时间越长，表明其在每一分钟时间点上的抗性越强。轻敲装置所在的实验台以惊吓果蝇，确保所有能够活动的果蝇均开始移动。每次轻敲后观察果蝇10秒，使其有足够时间开始移动或翻转身体，每个时间点间隔为1分钟。记录实验开始时八只果蝇中有多少只处于静止状态。大多数果蝇在受到惊吓后会迅速沿小瓶壁向上爬行。经过约6分钟的100%乙醇暴露后，它们开始行动迟缓，到12分钟时有时会出现不规则移动。大多数果蝇将处于静止状态，无法行走或从仰卧姿势翻身。只有能够自行翻身并行走的果蝇才应被计为可移动果蝇；仅在原地活动腿部或翅膀的果蝇应被计为静止果蝇；在整个观察期间始终保持仰卧状态的果蝇也应被计为静止果蝇，因其无法自行翻身是中毒的表现。在整个10秒观察时间内持续剧烈振动翅膀的果蝇同样应被计为静止果蝇，即使其位置发生改变。这些果蝇在快速振翅的间隙绝大多数时间处于静止状态。总之，能够翻身并行走的果蝇属于活动状态，而无法翻身、仅能原地活动腿和翅膀或快速振动翅膀的果蝇则属于静止状态。如果我们应用这些标准，会发现随着暴露于乙醇蒸气的时间（分钟）增加，更多的野生型果蝇会进入静止状态。该实验用于量化乙醇敏感性的指标是中位镇静时间（median sedation time, MST）。我们将 MST 定义为暴露室中八只果蝇中有四只变为静止状态所需的乙醇暴露时间（分钟）。如果在某一特定观察时间点恰好有四只果蝇处于静止状态，则该值可直接确定。例如，若在暴露 11 分钟后恰好有四只果蝇静止不动，则 MST 为 11。如果在暴露11分钟后恰好有四只果蝇处于静止状态，并且在12分钟时仍保持相同状态，则应取该时间点作为果蝇首次达到静止时间（ST）的值。若在某一观察时间点恰好没有四只果蝇静止，则需通过线性插值法计算四只果蝇达到静止状态的时间。例如，若在暴露9至10分钟之间，静止果蝇数量从三只跃升至五只，则可通过图形法确定平均静止时间（MST）为9.5分钟。以下通过本实验方法收集的数据表明，该实验设计是测量乙醇敏感性的准确方法。以下实验使用了六至八管样品，具体数量在图示中标注。暴露于100%乙醇的雄性野生型果蝇的平均生存时间（MST）约为11分钟，标准误差较低。日间变异较小，大多无统计学显著性，但我们仍建议您在同一天平行测量实验组和对照组。还需注意，A天和B天暴露处理的果蝇并非同一群体个体，而是来自相同遗传品系的兄弟姐妹。雄性和雌性果蝇在100%乙醇暴露下均未表现出平均存活时间（MST）的差异，但我们仍建议固定使用单一性别进行实验。如果我们让雄性和雌性果蝇暴露于逐渐增加的乙醇剂量下，会得到一条良好的剂量-反应曲线，显示随着乙醇浓度的升高，运动抑制时间（MST）呈统计学显著下降。该检测方法还能重现先前发表的表型，这些表型是使用更复杂的乙醇汽化装置测得的：携带“right rabbit one”突变的果蝇表现出MST显著增加。这一增加在100%和90%乙醇浓度下均被观察到。利用该实验方法，我们还可以在果蝇中诱导并测量乙醇耐受性。耐受性定义为：在预先暴露于乙醇以诱导耐受后，果蝇对乙醇的反应性降低。将一管果蝇暴露于乙醇中，时间约为其平均昏迷时间（MST）的两倍。例如，我们将这些雄性柏林野生型品系果蝇暴露于100%乙醇中24分钟。处理后，轻轻敲击将八只果蝇重新送回其食物小瓶中，让其恢复4小时。在恢复4小时后，记录果蝇最初的MST值；随后将同一批果蝇再次暴露于相同剂量的乙醇中，并记录其第二次的MST值。如图所示，果蝇在第二次接触乙醇时的昏迷时间（MST）显著长于第一次接触时的MST，表明果蝇已对乙醇的镇静作用产生了耐受性。耐受性的量化方法是：将同一管果蝇第二次的MST除以第一次的MST，再减去1，所得数值以百分比形式表示耐受性水平，在本例中约为50%。感谢观看，祝您的实验顺利成功。

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一个简单的方法来衡量在果蝇的乙醇灵敏度

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