Grabación de células enteras de una rebanada preparación organotípicos del neocórtex

El objetivo general de este procedimiento es obtener registros eléctricos de neuronas parametálicas en cortes organotípicos de neocórtex. Esto se logra cortando primero cortes agudos de ratas a las edades postnatales de P 8 a P 10. El segundo paso del procedimiento es afectar a la transfección de Bic de CD NA. El tercer paso del procedimiento es cultivar las rodajas durante tres a siete días.

El paso final del procedimiento es obtener registros eléctricos de las celdas transfectadas utilizando una pinza amperimétrica de corriente o voltaje. En última instancia, se pueden obtener resultados que muestran que las células parametálicas en cortes organotípicos tienen propiedades similares a las de los cortes agudos de la misma edad. La transfección de GFP no altera estas propiedades, lo que permite el estudio de las neuronas después de las manipulaciones genéticas de los canales iónicos a través de registros de corriente de toda la célula o de pinza de voltaje.

La principal ventaja de esta técnica es, a diferencia de los cortes agudos, es que las células pueden mantenerse en un entorno normal durante el tiempo suficiente para poder manipular genéticamente los canales iónicos. El método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de los canales iónicos, como las funciones de tipos específicos de canales iónicos, Prepare la campana de flujo laminar, la campana de flujo al vacío, los suministros quirúrgicos y las soluciones como se especifica en el manuscrito adjunto. Use guantes para todos los pasos posteriores después de filtrar la solución de corte preparada de 250 mililitros alícuota 40 mililitros en un vaso de precipitados de 50 mililitros.

Coloque la cámara de corte, la alícuota de 40 mililitros y los 210 mililitros restantes de la solución de corte en el congelador a menos 20 grados centígrados debajo de la campana de flujo laminar. Coloque 1,1 mililitros de medio de cultivo en tres pocillos diagonales de una placa de seis pocillos. Repita esto por un segundo.

Placa de seis pocillos. Coloque las seis placas de pocillos en una incubadora a 37 grados centígrados durante al menos una hora. A continuación, utilice unas tijeras estériles para acortar cuatro pipetas de transferencia que se utilizarán para transferir las rodajas.

Otras tres pipetas se mantienen intactas cuando las soluciones se han convertido en mezclas fangosas. Retire la alícuota de 40 mililitros de solución de corte del congelador y colóquela debajo de la campana de vacío. Burbujea con 95% de oxígeno, 5% de dióxido de carbono.

A continuación, retire los 210 mililitros de solución de corte del congelador y colóquela bajo la burbuja de la campana de flujo laminar. También con 95% de oxígeno, 5% de dióxido de carbono. A continuación, retire los medios de lavado del refrigerador y burbujee con oxígeno al 100% debajo de la campana de flujo laminar.

Coloque dos mililitros de medio de cultivo en una placa de Petri. Coloque los medios de cultivo restantes en el refrigerador para cambiarlos durante la semana para prepararse para el corte del cerebro. Vierta unos 10 mililitros de solución de corte en frío del vaso de precipitados de 50 mililitros en un vaso de precipitados de 25 mililitros debajo de la campana de vacío.

Después de la anestesia y la decapitación, se extrae el cerebro de un día postnatal, de ocho a 10 ratas. Lave el cerebro en el vaso de precipitados que contiene 30 mililitros de solución de corte en frío durante unos 30 segundos. A continuación, transfiera con cuidado el cerebro al vaso de precipitados de 25 mililitros.

Cambie los guantes y empape los guantes con etanol. A continuación, lleve el cerebro en la solución de corte en frío a la campana de flujo laminar. El siguiente paso es orientar y bloquear el cerebro mediante la extirpación del cerebelo y el polo frontal y hacer un corte parcial del sagital medio que pegue el cerebro bloqueado en el escenario con la corteza frontal hacia arriba.

Haga cortes adicionales con bisturí según sea necesario para restringir el tamaño de las rebanadas. A continuación, coloque la etapa con el cerebro en la cámara de corte de metal esterilizada. Conéctelo a la cortadora de pañuelos vibratoria.

Llene el baño con una solución de corte burbujeante helada. Vierta 30 mililitros de la solución de corte restante en un vaso de precipitados de 50 mililitros y burbujee con 95% de oxígeno y 5% de dióxido de carbono. Este vaso de precipitados se utilizará para recoger las rodajas.

Corta cortes coronales de 250 micras de la corteza parietal frontal. Coloque al menos seis rodajas en el pico de 50 mililitros que contiene la solución de corte. A continuación, coloque unos dos mililitros de medios de lavado en una placa de Petri de 35 milímetros.

Con una pipeta de corte, transfiera las rodajas de la solución de corte a la placa de Petri que contiene los medios de lavado. Lave las rodajas tres veces con pipetas nuevas para agregar medios y para aspirar las soluciones de desecho después del lavado, transfiera las rodajas a la placa de Petri de 35 milímetros que contiene los medios de cultivo. A continuación, retire la parte superior del empaque para los insertos de malla, pero deje los insertos en los paquetes.

A continuación, utilice unas pinzas para levantar un inserto de malla de su paquete con una pipeta de transferencia de corte. Transfiera un sector del medio de cultivo a la malla. Inserte y coloque la rebanada en el centro de la membrana con una pipeta de transferencia intacta.

Elimine el exceso de medios de cultivo. Ahora. Coloque el inserto de malla con su corte en uno de los pozos llenos de líquido de la placa de seis pocillos. Tenga cuidado de evitar la formación de burbujas de aire debajo de la malla después de colocar una rebanada en cada uno de los pozos llenos de líquido.

Vuelva a colocar las seis placas de pocillos en la incubadora e incube a 37 grados centígrados durante aproximadamente una hora. Mientras tanto, limpie el área de trabajo debajo de la campana de flujo laminar en preparación para la transfección. El siguiente paso es cargar la pistola genética BioRad Helios, dejando libre la primera posición.

Cargue un cartucho que contenga balas recubiertas de CD NA en cualquier otra posición del soporte del cartucho de la pistola genética. A continuación, coloque el soporte del cartucho en la pistola genética. Primero, limpie el arma disparando un cañón sin balas.

A continuación, avanza el cañón hasta un cartucho que contiene CDNA. Balas. Tome las placas de seis pocillos de la incubadora y colóquelas debajo de la campana de flujo laminar, sosteniendo el arma verticalmente justo por encima de la parte superior de la placa de seis pocillos, dispare un corte a 100 PSI, luego avance el cañón y límpielo nuevamente disparando una bala de fogueo. Dispara las rebanadas restantes con un disparo por rebanada.

Después de disparar, regrese las placas de seis pocillos a la incubadora e incube las rodajas a 37 grados centígrados durante dos a siete días con 5% de dióxido de carbono durante el período de incubación. Reemplace el medio cada dos días de la siguiente manera, trabajando debajo de la campana de flujo laminar, agregue nuevos medios a los tres pozos desocupados. Luego, vuelva a colocar la placa de seis pocillos en la incubadora durante al menos una hora, después de una hora, regrese la placa de seis pocillos a la campana laminar y use pinzas curvas limpias con etanol para mover cada inserto de malla y su corte a un nuevo pocillo, aspire el medio viejo y devuelva la placa a la incubadora.

Después de varios días de incubación, los cortes ya están listos para el registro de células completas. Retire una placa de seis pocillos de la incubadora debajo de la campana de flujo laminar. Utilice pinzas curvas limpias con etanol para quitar un inserto de malla y su rebanada.

Luego reemplace la placa de seis pocillos en la incubadora. A continuación, transfiera la placa de Petri con un inserto de malla y córtela en rodajas a la zona de grabación, aplicando tensión con pinzas o una pieza flexible de metal. Use un bisturí número 11 para cortar la malla alrededor de la rebanada si es necesario, termine los cortes finales con las tijeras.

A continuación, utilice pinzas para transferir el corte y la malla adjunta a la cámara de grabación. En la platina de un microscopio vertical, bañe la rebanada en líquido cefalorraquídeo cerebral artificial relacionado con el cárbogen bajo la óptica IR DIC. Visualice las neuronas parametálicas en las capas dos, tres o cinco bajo epifluorescencia y el filtro Fitz.

Localice las células verdes transfectadas bajo microscopía IR DIC. Busque las balas de CDNA, que aparecen como pequeños puntos negros dentro de las celdas. Seleccione una celda transfectada para la grabación de celda completa.

A continuación, avance un microelectrodo a la celda seleccionada y use una succión suave para lograr un sello de giga ohmios. A continuación, aplique succión adicional para entrar en la célula y obtener una célula completa. Grabación. La celda ahora está lista para grabaciones de pinza amperimétrica de corriente o voltaje.

Esta figura muestra una imagen fluorescente de células transfectadas con CDNA para GFP. Las siguientes grabaciones se toman de células transfectadas con CDNA para GFP. Aquí se muestra un potencial de acción en una celda parametálica de capa tres en respuesta a una inyección de corriente de 10 milisegundos por encima del umbral

Esta figura muestra el disparo repetitivo de una neurona parametálica de capa cinco en respuesta a una inyección de corriente de 400 picos amperios de dos segundos. Esta figura muestra un registro de pinza de voltaje de una neurona parametálica de capa cinco. La tetrodatoxina se utilizó para bloquear la corriente de sodio dependiente de voltaje.

Las trazas representan corrientes de potasio hacia el exterior provocadas por una familia de pasos de voltaje de 500 milisegundos a partir de un potencial de retención de menos 70 milivoltios. Una vez dominado, la ligera preparación y transfección se puede realizar en unas dos horas, incluido el tiempo de preparación. Al intentar este procedimiento.

Es importante mantener las condiciones de esterilidad y restringir el grosor y las dimensiones de la loncha para evitar que se seque. Gracias por mirar. Buena suerte con tu experimento.

Gracias.