El aislamiento de Drosophila melanogaster Testículos

El objetivo general de este procedimiento es aislar testículos de cero a tres días de edad machos de Drosophila melan gaster. Esto se logra anestesiando a las moscas macho y diseccionando sus testículos en una gota de hielo. El PBS frío bajo un microscopio con dos agujas de disección, separa el abdomen de la mosca de su tórax.

Por último, separar los testículos del resto del tejido y recogerlos para utilizarlos en una variedad de técnicas analíticas, como la inmunofluorescencia, la tinción o el aislamiento de proteínas y ARN total. La demostración visual de este método es fundamental, ya que la identificación de los testículos disecados puede ser difícil de aprender porque son difíciles de distinguir del intestino. La demostración del procedimiento estará a cargo de shemei ma, un técnico de mi laboratorio.

Primero reúna un balde de hielo, agujas de disección y unos 100 mililitros de solución salina tamponada con fosfato. Coloque el PBS en la cubeta de hielo para que se enfríe. Haga un portaobjetos de microscopio con un fondo negro cortando papel blanco de 20 libras para que se ajuste al portaobjetos.

Y luego colorea un lado de negro. Con un rotulador permanente, pegue el papel en su lugar en el portaobjetos y asegúrelo a la almohadilla de CO2. Bajo un microscopio de disección en el microscopio de disección, anestesiar un frasco de moscas de cero a tres días de edad con un chorro de CO2 y vaciarlas en la almohadilla.

Cerca del portaobjetos del microscopio adjunto, identifique las moscas macho por sus característicos ganchos de apareamiento de color oscuro y clasifique entre 50 y 100 pipetas de unos 50 microlitros de PBS helado en el centro del microscopio. Desliza formando una gota. Recoge una mosca macho sumergiendo una aguja de disección en la gota de PBS y tocando suavemente el lado ventral de la mosca, haciendo que se pegue a la aguja.

Coloque la mosca en la gota de PBS, presione firmemente una aguja entre el tórax y el abdomen de la mosca. Presione la otra aguja entre el sexto y el séptimo segmento abdominal y luego separe el abdomen del tórax. Separa los testículos del resto de los órganos, especialmente del intestino, que puede tener un aspecto similar para ayudar a diferenciar los testículos en el intestino.

Recuerde que los testículos siempre salen, los pares tienen una forma de espiral característica y son más blancos que el tejido intestinal. Recoja los testículos en un tubo de microcentrífuga que contenga PBS helado y guárdelos en hielo donde puedan almacenarse durante varias horas. Una vez mostaza, una mosca puede ser diseccionada en menos de un minuto siguiendo este procedimiento.

Se pueden realizar otros métodos, como la secuenciación profunda de pequeños ARN silenciadores o microARN, para responder a preguntas adicionales, como ¿cómo cambia el repertorio de ARN en una mosca mutante en particular?