Aktif Bölgeleri Diseksiyon ve Görüntüleme Drosophila Nöromüsküler Junction

Bu prosedürün genel amacı, drosophila üçüncü ve yıldız larvalarında aktif bölge proteinleri için bir immünofloresan boyama yapmaktır. Bu, önce larvaların seçilmesi ve diseksiyon kabına sabitlenmesiyle gerçekleştirilir. Prosedürün ikinci adımı, kasları ve nöromüsküler kavşakları ortaya çıkarmak için fazla dokuyu çıkararak larvaları incelemektir.

Prosedürün üçüncü adımı, disseke edilmiş larva postlarını doğrudan diseksiyon kabında immün olarak boyamaktır. Prosedürün son adımı, larva postlarını bir mikroskop lamı üzerine monte etmektir. Sonuç olarak, immünofloresan mikroskobu ile CHO nöromüsküler kavşak aktif bölge morfolojisi ile sonuçlar elde edilebilir.

Bu yöntem, nöroloji alanında, bir zamanlar aktif bölge morfolojisinde yer alan nöromüsküler kavşak proteinlerinin düzenlenmesi gibi temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bir diseksiyon yüzeyi oluşturmak için, puro, 180 4 silikon elastomer tabanını küçük bir doku kültürü plakasına dökün. Diseksiyon alanı kenardan daha düşük olacak şekilde plakayı tamamen doldurmadığınızdan emin olun Daha fazla manipülasyon kolaylığı için diseksiyon pimlerini yaklaşık üç ila beş milimetre uzunluğunda kesin ve vahşi tip ve mutant suşlardan larva başına en az altı pim olduğundan emin olun. Şişenin duvarının etrafında aktif olarak sürünen ve pupa olmaya başlamamış olan dolaşan üçüncü instar larvalarını tanımlayın ve seçin.

Her genotipten iki larvayı şişelerden çıkarın ve stereo mikroskop altında kalıntıları gidermek için PBS ile doldurulmuş bir yıkama kabına koyun. Kim mendili kullanarak diseksiyon yüzeyindeki fazla nemi alın. Larvaları, sırt tarafı yukarı bakacak ve larva Merkezinin sırt tarafı boyunca iki beyaz trakea görünecek şekilde düzenleyin.

Larvaların ortasındaki trakealar, dorsal orta hat yerini işaretlerken. Ağız kancalarının hemen üzerine bir numaralı pimi yerleştirin ve ardından iki numaralı pimi kuyruk konumuna kürelerin hemen üzerine ve trakeaların arasına yerleştirin. Kütikülün kurumasını önlemek için larvalara az miktarda PBS ekleyin.

Her grup arasına bir iğne yerleştirerek farklı genotipleri ayrı tuttuğunuzdan emin olun. Larvalar sabitlendikten sonra, iki numaralı pimin hemen üzerinde trakealar boyunca enine bir kesim yapın. Makasınızı bu kesiğe sokun ve gerekirse soluk borusu arasındaki dorsal orta hat boyunca bir numaralı pimi geçecek şekilde kesin.

Kütikülün her iki tarafının en üstünde ve altında dört ek küçük kesi yapın, böylece sol ve sağ taraflar açılacak ve kütikülü çekmeden onları sabitlemenize izin verin. Kütikülün her bir köşesi diseksiyon pedine düz bir şekilde sabitlendikten sonra, fileto larvalarını oda sıcaklığında 20 ila 25 dakika boyunca% 4 para formaldehit ile sabitleyin. Yaklaşık 25 dakikalık fiksasyon süresinden sonra, paraform aldehiti boşaltın ve her seferinde stereo mikroskop altında bir damla PBS içinde larvalarla birlikte PB S3 kez durulayın, trakealardan birinin arka ucunu diseksiyon forsepsleri ile tutun ve dışarı çekin.

İkinci trakea için tekrarlayın. Arka yağ gövdesinin veya bağırsak dokusunun bir kısmını alın ve diseksiyon alanından dışarı çekin. Arka dokunun çoğu çıkarıldıktan sonra, beynin etrafındaki küçük dokuları çıkarmaya odaklanın.

Larva postu fazla dokudan arındırıldıktan sonra, aktif bölgeyi tanımak için bir birincil antikor ve ardından bir floresan ikincil antikor kullanılarak doğrudan diseksiyon pedi üzerinde boyanabilir. Aktif bölgenin immünofloresan boyanmasından sonra, bir sonraki adım immünostain larva postlarını monte etmektir. İkincil antikor inkübasyonunu takiben son yıkamayı boşaltarak ve emerek başlayın ve yaklaşık bir mililitre %80 gliserol pipetleyin. Larva postlarını aşağı doğru kapatmak için, her larvadan bir pim hariç tümünü çıkarın ve ardından iki damla montaj ortamını bir mikroskop lamına yerleştirin.

Son pimi çıkarın ve larvaları künt forseps ile kuyruğundan tutun. Larvaları gliserolün içinde sürükleyin ve ardından larvaları ilk montaj ortamı damlasına yerleştirin ve aynı genotipin kalan larvaları için de aynısını yapın. Tüm larvalar ilk montaj ortamı damlasına girdikten sonra, larvaları tek tek tutun ve ortamın çoğunu çıkarmak için damla boyunca ve ardından slaydın kuru kenarları boyunca sürükleyin.

Ardından larvaları ikinci montaj ortamı damlasına yerleştirin. Son slaydı etiketleyerek ve slaydın üzerine küçük bir T şeklinde montaj ortamı yerleştirerek hazırlayın. İkinci montaj ortamı damlasında larvalar ile sürükle ve kurutma prosedürünü tekrarlayın ve ardından larva kütikül tarafı aşağı bakacak şekilde montaj ortamına yerleştirin.

Son slaytta, disseke edilmiş larvaları başlangıç kenarı ile örtmek için slaydın üzerine bir kapak fişi yerleştirin Tişörtün üst satırında, montaj ortamının tamamen yayılmasını sağlamak için kapak fişinin üzerine yaklaşık beş dakika küçük bir ağırlık yerleştirin ve ardından montaj ortamı sertleşene kadar karanlıkta bekletin. Slaytı mikroskopiye hazırlamak için, kalan montaj ortamlarını silin ve kapak kızağını tırnak cilası ile kapatın. Monte edilmiş larva postlarının doğru oryantasyonu burada gösterilmiştir.

Postların kütikül tarafı aşağı bakacak şekilde düz olduğuna ve peletler arasında en az bir larva gövdesi genişliği olduğuna dikkat edin. Larva diseksiyonları, boyama ve montaj tamamlandıktan sonra. Mikroskopi, iki ila altı segmentlerde bulunan ilgilenilen larva kasını tanımlamak için kullanılabilir.

Yüksek güçlü bir objektif kullanarak, tek bir sinapsa odaklanabilir ve mikroskopla bir ZS yığını görüntüsü alınabilir. Burada, yeşil NC 82 boyaması ve kırmızı HRP pre-sinaptik boyası ile sinapsın bir kısmının temsili bir maksimum projeksiyon görüntüsü gösterilmektedir. Bu videoyu izledikten sonra, aktif bölge morfolojisinde yer alanlar gibi önemli nöromüsküler kavşak proteinleri için nasıl immün lekeleme yapılacağını iyi anlamış olmalısınız.