Vibrodissociation des neurones à partir de tranches de cerveau de rongeurs pour étudier la transmission synaptique et de l'image terminaisons présynaptiques

L’objectif global de l’expérience suivante est d’isoler les neurones qui conservent des bâtons synaptiques attachés et pincés qui permettent un contrôle pharmacologique et une meilleure pince d’espace tout en éliminant l’influence des cellules voisines. Ceci est réalisé en préparant des coupes cérébrales aiguës de rats ou de souris du jour postnatal P un à P 21 contenant la zone cérébrale d’intérêt pour isoler les neurones individuels dans un deuxième temps. Les tranches aiguës sont placées dans un plat et une micro-pipette en verre scellée à la flamme est vibrée dans la zone d’intérêt tout en déplaçant la pointe à travers la tranche, ce qui libère les neurones individuels.

Les neurones ont le temps de se fixer au fond de la boîte. Ensuite, la boîte contenant les neurones fibrodissociés est déplacée vers un microscope afin d’examiner la physiologie synaptique, la pharmacologie, la modulation, la plasticité, ainsi que l’imagerie en temps réel et la caractérisation des éléments pré et post-synaptiques dans les cellules vivantes Les résultats sont obtenus qui montrent les caractéristiques physiologiques et pharmacologiques des réponses synaptiques et les modifications associées de la fonction terminale présynaptique à travers un joint étanche, Enregistrement de cellules entières et microscopie à fluorescence. Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes telles que l’enregistrement à partir de tranches de cerveau, de neurones cultivés et de neurones dissociés enzymatiquement, est que le bns synaptique sensible attaché permet le contrôle et la visualisation des éléments présynaptiques, tandis que la structure postsynaptique relativement compacte permet une meilleure tension clamp et un contrôle exceptionnel de l’environnement extracellulaire.

En général, les personnes qui débutent dans cette méthode auront du mal car le rendement pour obtenir des neuros sains peut varier considérablement en fonction de plusieurs conditions, telles que l’âge de l’animal, les paramètres de vibration et la zone d’intérêt dans la tranche. De plus, les enregistrements cellulaires des individus persistent moins longtemps que dans les lames conventionnelles. Enregistrements. La démonstration visuelle de cette méthode est essentielle car les étapes de dissociation de l’IV sont difficiles à apprendre car il est difficile de décrire avec précision la distance de mouvement et la dissidence à travers la tranche I Pour se préparer à la fabrication des tranches de cerveau, préparez une bulle artificielle de liquide céphalo-rachidien A avec du carbogène pendant 15 minutes.

Ensuite, ajoutez-y deux millimolaires de chlorure de calcium et un millimolaire de chlorure de magnésium. Après avoir anesthésié et décapité un animal d’âge postnatal de P un à 21 ans, retirez le cerveau, puis coupez-le dans l’orientation souhaitée de manière à inclure la région d’intérêt. A fixer le cerveau disséqué à un stade et l’immerger dans une chambre remplie de LCR.

Ensuite, montez la chambre sur une trancheuse à cerveau et sectionnez le cerveau à une épaisseur de 250 à 400 micromètres par tranche avec une lame vibrante. Placez des tranches de LCR A et faites-les bouillir avec du carbogène dans une chambre de pré-incubation pendant au moins une heure. Pour préparer une micro-pipette en verre scellée à la flamme, tirez d’abord sur une micro-pipette standard avec un diamètre de pointe de deux micromètres sur un extracteur de micro-pipette brun flamboyant ou équivalent.

Placez la pointe de la micro-pipette dans la flamme d’un bec Bunsen pendant environ deux secondes pour former une boule fusionnée de 200 à 300 micromètres de diamètre. Ensuite, placez la pipette patch scellée à la flamme sur un support du micromanipulateur qui peut être rapidement vibré d’un côté à l’autre avec une distance de déplacement de 100 à 200 micromètres à l’aide d’un relais électrique bimorphe piso ou d’un dispositif d’efficacité équivalente. Préparez des tas de solution saline tamponnée.

Ajustez la solution avec de l’hydroxyde de sodium à pH 7,4 et l’osmolarité avec du saccharose à environ 300 milli d’osmoles. Remplissez ensuite une boîte de culture de 35 millimètres de diamètre avec une solution saline tamponnée en tas. Placez une tranche dans la boîte de culture, visualisez-la avec un stéréoscope de dissection à un grossissement de 250 x avec un fil plié.

Tenez la tranche au fond du plat pour dissocier les cellules. Positionnez l’extrémité de la micropipette scellée à la flamme sur la surface de la tranche. Activez le micromanipulateur de manière à ce que la pointe vibre latéralement de 10 à 30 hertz avec une distance d’excursion d’environ 100 micromètres.

Abaissez la pointe de la micropipette dans la tranche à l’aide du manipulateur microm de manière à ce qu’elle coupe toute la profondeur en 30 secondes. Répétez cette étape si nécessaire pour maximiser le nombre de neurones isolés. Ensuite, retirez la pointe de la tranche.

Prenez la tranche à l’aide d’une pince et secouez-la doucement dans la solution. Retirez ensuite complètement la tranche de la solution. Laissez les cellules se déposer au fond du plat pendant au moins 10 minutes.

Placez la parabole contenant les neurones sur la platine d’un microscope inversé et visualisez-les avec un objectif de un x à 63 x. Recherchez les neurones qui ont des membranes lisses sans bavardage et détectables, mais pas de noyaux surdimensionnés. Si l’on utilise une optique de contraste de phase, recherchez les neurones lumineux en phase avec une teinte jaunâtre, mais pas trop bleue.

Tirez une micro-pipette patch standard à l’aide d’un extracteur brun flamboyant ou équivalent avec une résistance de pointe de pipette de deux à quatre méga ohms. Remplissez la pipette patch avec une solution intracellulaire à base de chlorure de césium pour mesurer les réponses synaptiques ou une solution intracellulaire à base de chlorure de potassium pour mesurer les propriétés intrinsèques de la membrane et les potentiels d’action. Effectuez une pince de patch de cellule entière sur le neurone à l’aide de techniques électrophysiologiques standard.

Enregistrez d’abord les courants post-synaptiques spontanés à l’aide d’un protocole d’acquisition de données sans lacune. Ensuite, appliquez une solution extracellulaire contenant 200 nan d’animaux ou de tetrotoxine et/ou à faible teneur en calcium pour enregistrer des courants post-synaptiques miniatures afin de modifier le contenu moléculaire extracellulaire. Les médicaments d’intérêt sont chargés individuellement dans l’un des barils d’un tube de verre à pointe carrée fusionnée, qui est positionné près du neurone d’intérêt.

Un baril individuel est exposé au neurone par un micromanipulateur entraîné par un moteur pas à pas qui se déplace latéralement pour permettre l’échange de solution de 10 à 100 millisecondes. Regardez les bns téléchargés à fort grossissement avec un objectif à grande ouverture numérique dans un microscope à caméra ou un microscope multiphotonique. Voici l’image d’un neurone et de bns capturés avec une caméra de dispositif couplé à la charge multiplicatrice d’électrons.

La puissance de la source lumineuse pour l’excitation a été atténuée à 1,2 % avec un filtre à densité neutre de 1,0 et un filtre à iris ajusté à 12 % de sortie pendant les enregistrements par pince de tension. Avec une solution intracellulaire à base de chlorure de césium, des courants synaptiques spontanés sont observés pour visualiser la fusion vésicale. Dans les bâtons présynaptiques, nous avons utilisé des souris exprimant la construction synaptique du florin sous le contrôle du promoteur TH un.

Le florin synaptique est une construction moléculaire dans laquelle le florin écliptique, un mutant GFP avec une sensibilité accrue au pH, est lié à la protéine membranaire associée vésicale lors de la fusion vésicale. Ce motif est exposé à l’environnement extracellulaire plus neutre, ce qui entraîne une augmentation de la fluorescence aux points qui correspondent aux vésicules et aux terminaisons présynaptiques. La fibrodissociation des neurones de l’hippocampe de ces souris permet de visualiser des points fluorescents de la taille et de l’emplacement attendus pour les terminaux GABAergiques lors de la tentative de cette procédure.

Il est important de se rappeler que pour avoir des neurones sains, vous devez vous assurer que vous avez des tranches saines. Par conséquent, la préparation de coupes cérébrales aiguës est une étape importante dans cette procédure Après cette procédure. D’autres méthodes telles que l’immunohistochimie ou la RT PCR R sur cellule unique peuvent être effectuées afin de répondre à des questions supplémentaires telles que les protéines et les espèces d’ARNm exprimées dans les bâtons synaptiques ou les neurones postsynaptiques.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’obtenir des neurones isolés sains et de les utiliser pour l’électrophysiologie ainsi que pour l’imagerie en temps réel.