Name: Transplante de Células-Tronco cirúrgica do rato Neural na medula espinhal de camundongos infectados com o vírus da Hepatite neurotrófico rato (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-07-10T22:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 33 s
Description: Aprenda o transplante cirúrgico de células-tronco neurais na medula espinhal de camundongos infectados com JHMV para promover remielinização. Este método viabiliza estudos de terapias de reposição celular em doenças desmielinizantes.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

1. Preparação <ol><li> Prepare xilazina-cetamina solução (ketamina é uma substância controlada. Registros detalhados devem ser mantidos e soluções armazenadas em um local seguro e trancado). </li><li> Limpar e esterilizar equipamentos. </li><li> Prepare área da cirurgia, limpando com o agente de assepsia e, em seguida, cobrir com papel toalha estéril, e configurar o micromanipulador. </li></ol> 2. Preparação de células para transplante <ol><li> As células devem ser ressuspendidas a uma concentração de 100.000 células / l E e, apesar de apenas 250.000 células são transplantadas por mouse, um excesso de células é necessário para fins de seringa de carga (preparar pelo menos 300 mil células por camundongo que receberam células). </li><li> Lave as células a serem transplantadas 3 vezes em HBSS num frasco de 50 ml. Contar as células antes do spin-final. </li><li> Após a centrifugação final para baixo, e deixar decantar HBSS frasco em posição de cabeça para baixo para evitar que gotas de alcançar o sedimento. </li><li> Seca paredes interiores com um UV-irradiados Kimwipe, estéril. Não permita que o pellet para secar. </li><li> Segurando o tubo na posição vertical, lenta e delicadamente ressuspender as células em metade do volume final desejado de HBSS. </li><li> Medir o volume total por pipetagem a maioria da suspensão em uma ponta da pipeta e então ajustando o dial na pipeta até a suspensão inteira está na ponta da pipeta. Isso vai te dizer o quanto HBSS mais é necessário para a concentração desejada. </li><li> Traga de volume para a quantidade desejada, adicionando HBSS. </li><li> Coloque de volta no gelo. Verificar a viabilidade das células se deve ser sobre o gelo por mais de 2 hrs. </li></ol> 3. Preparação de ratos para a cirurgia e transplante <ol><li> Anestesiar o rato por injeção intraperitoneal de ketamina (100mg/kg) e xilazina (10mg/kg) em ~ 100 mL doses ou por um anestésico equivalente. Todo o processo de preparação cirúrgico para sutura terá de 30-40 minutos. </li><li> (Opcional: aplique fita numerada, colorido para a cauda de cada rato para assegurar a identificação) </li><li> Raspar a área dorsal do mouse a partir da parte inferior das costas para o pescoço, e estendendo dois centímetros da linha média bilateral, com tosquiadeiras elétricas. O cabelo deve ser cortado o mais próximo possível (pode ser necessário para ir sobre a área várias vezes). </li><li> Para remover os pêlos restantes, aplique uma camada fina de creme de depilação (Nair) com uma gaze aplicador derrubado. </li><li> Depois de 1-2 minutos, limpe Nair off com gaze umedecida levemente com água e sabão. A área preparada deve ser limpa a pele nua, sem peças perdidas de cabelo que poderiam entrar na ferida durante o procedimento cirúrgico subseqüente. Esterilizar a área preparada com solução de iodeto. </li></ol> 4. Laminectomia <ol><li> Mudam freqüentemente e / ou esterilizar as luvas durante o procedimento. Posição ao lado do mouse dorsal com a cabeça apontando para a esquerda (se você for destro). Drape animais para garantir a esterilidade e que apenas a área raspada está exposto. Faça uma incisão vertical (~ 1,3 cm) sobre o local laminecomy spanning de cerca de vértebras torácicas T8 a T12. </li><li> Com a pinça zu na mão esquerda, prender firmemente a coluna vertebral em T9 (Figura 1A) e levante o mouse até a exagerar a curvatura da coluna vertebral. </li><li> Use o bisturi para marcar a junção entre T10 e T11, o espaço entre as duas saliências espinhosas. Ainda expor a junção com cuidado a demolição da camada muscular para expor o osso (ver Figura 1B, C). </li><li> Use a tesoura para mais músculo clara distância da lâmina e em torno do pedículo com snips pequenos. Isto irá abrir um pequeno espaço entre as vértebras. Lenta e delicadamente inserir uma lâmina da tesoura para essa lacuna e snip do pedículo. Certifique-se a curvatura da tesoura é sempre posicionados lateralmente, longe do cabo. Repita no outro lado. (Ver Figura 1D, E) </li><li> Levante a lâmina para expor o cabo e cuidadosamente snip-lo. Não se esqueça de deixar qualquer fragmentos de ossos livre ou irregulares para trás. (Ver Figura 1F) </li><li> Antes da injeção, limpar o sangue para fora com cotonetes estéreis. </li></ol> 5. Injeção de células <ol><li> Coloque a agulha com agulha porca para a seringa Hamilton e limpá-los através de lavagem com água várias vezes, então 70% de etanol e, finalmente, HBSS. Inserir êmbolo após cada enchimento com água, etanol 70%, ou HBSS. </li><li> Prepare a seringa Hamilton para carregar celular através da remoção do êmbolo e soltando a porca agulha e puxando a agulha para longe da seringa para evitar contrapressão. Garantir que a manipulação cuidadosa da agulha e porca é feito com luvas estéreis. </li><li> Carga 15μl de células em pipeta ponta e pressione a ponta firmemente na extremidade traseira da seringa para carregar as células dentro da seringa. </li><li> Insira o êmbolo aproximadamente 5mm e, em seguida, apertar a porca da agulha. </li><li> Deprimem êmbolo unaté alguns da suspensão de células foi visto saindo da agulha. </li><li> Certifique-se que não há bolhas na seringa e colocar a seringa na posição horizontal para evitar que as células de fazer um gradiente de gravidade. </li><li> Agarrar o mouse laminectomized pelo músculo spinalis dorsi conectando os espinhos de T8 e T9 (Figura 2B, C). </li><li> Prender o hemostat para o braço esquerdo micromanipulador (vertical) para que as patas da frente do rato estão no ar e suas patas traseiras tocando levemente uma plataforma de toalhas de papel estéreis, nas Figuras 2A e 2B. </li><li> Conecte a seringa no braço direito micromanipulador (em um ângulo de 70 °) e deslize a seringa na posição mais baixa possível, antes de aperto. </li><li> Estabilizar o mouse fixando sua cauda contra as toalhas de papel e abaixe lentamente a seringa (Figura 2B). </li><li> Abaixe a agulha em direção ao cabo e insira a um milímetro agulha no hemisfério oposto através da linha média dorsal (Figura 2C). A ponta da agulha deve ser na substância cinzenta perto do canal central. </li><li> Injecte lentamente 2.5μl de células. Injetar a uma taxa de 1μl / 5 segundos. Depois de injetar as células, espere uns 10 segundos e retirar a agulha 1 / 10 de uma volta em um momento cada 10 segundos até que a agulha está fora do cordão. Preste atenção ao efluxo possível de suspensão celular. </li><li> Rapidamente retirar a seringa e retire-a do braço micromanipulador. Lay a seringa horizontalmente. </li><li> Solte o mouse e transferência para a mesa sutura. </li><li> Repita os passos 5,7-5,14 para cada rato até que a seringa é esvaziada. Esterilizar as ferramentas (no esterilizador) ea agulha (limpando com álcool) entre os animais. Descartar pilhas e recarregar se aglomeração é visível. </li><li> Limpe a seringa como no passo 5,1 entre as cargas. </li></ol> 6. Suturas e pós-operatório de cuidados <ol><li> Suturar a incisão. Agulha de sutura é inserida na fáscia superficial em ambos os lados da incisão. O fio é amarrada através de, puxando fáscia superficial juntos (Figura 3A), cobrindo assim a medula espinal exposta no local da lâmina removido. Não sutura do músculo cutâneo ligado à pele ou do músculo esquelético das costas. Puxe a linha através de todo, deixando cerca de 1 / 2 ". Usando o porta-agulha, três nós são formados e linha é cortada o mais próximo do nó possível. </li><li> Fechar a incisão através da aplicação de 2-3 grampos (dependendo do tamanho da incisão) para a pele (Figura 3B). Puxe cuidadosamente a pele longe do mouse para evitar grampear o músculo subjacente. </li><li> Usando um 26G3 / 8 agulha injetar 0,5 ml de Ringer Lactato de sub-cutânea na região lombar longe da incisão. </li><li> Colocar o mouse de volta em sua gaiola. Para garantir que ele é capaz de respirar confortavelmente enquanto sob anestesia, o mouse deve ser colocado de lado na gaiola, evitando o contato entre o local da cirurgia e roupa de cama gaiola. Gaiolas devem ser colocados em almofadas de aquecimento. </li><li> Ratos são monitorados após a anestesia desgasta fora para garantir subsídios sangramento, suturas permanecem fechadas, e que os ratos voltar ao pré-cirurgia de mobilidade. </li><li> Tratar ratos um tempo com a buprenorfina analgésico (0,05-0,1 mg / kg) após a cirurgia. </li><li> Garantir camundongos deficientes têm acesso suficiente a alimentos e água: garrafas de água estão equipados com bicos estendida 3,5 polegadas e ratos que são incapazes de andar de mão são alimentados de água e / ou de alto teor calórico suplemento dietético (Nutri-Cal, Tomlyn). </li></ol> 7. Resultados representativos: Resultados desejados será identificável pela falta de efluxo da suspensão de células durante a injeção e pelo aparecimento intactas da medula espinhal após o procedimento. Para este fim, é vital ter uma iluminação brilhante e direta na coluna do rato durante a laminectomia e durante a injeção. A iluminação ideal é facilitada pela iluminação de fibra óptica (Figura 2A). <img src="/files/ftp_upload/2834/2834fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1 - Laminectomia (A) Uma vez vértebra T9 está solidamente realizada com a pinça Graefe, (B, C) ​​pontuação da coluna vertebral com bisturi entre T10 e T11 para facilitar a entrada da tesoura micro.. (D) Deslize cuidadosamente a tesoura micro através do espaço entre T10 e T11 (setas e inset, E) e cortar os pedículos de cada lado (traços, E) para libertar a lâmina dorsal. (F) Virar a lâmina até rostralmente e cortá-lo. <img src="/files/ftp_upload/2834/2834fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. Injeção de NSCs. (A) A configuração geral do micromanipulador com o hemostat segurando o mouse conectado ao braço esquerdo e na seringa Hamilton no braço direito em um ângulo de 70. (B) O hemostat segurar o spinalis dorsi conectando os espinhos de T8 e T9. (C) A agulha é reduzido através de tele linha média e na matéria cinzenta no hemisfério oposto, proximal ao canal central. <img src="/files/ftp_upload/2834/2834fig3.jpg" alt="Figura 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 3"> Figura 3. Suturas e fechamento da ferida. (A) Suturas são aplicados à fáscia superficial em ambos os lados da incisão. (B) A incisão é fechada com grampos 03/02, conforme necessário (um grampo mostrado em uma ferida que necessitam 3).

<ol><li>Bergmann, C. C., Lane, T. E., Stohlman, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coronavirus+infection+of+the+central+nervous+system%3A+host-virus+stand-off%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Coronavirus infection of the central nervous system: host-virus stand-off.</a> Nat Rev Microbiol. 4, 121-132 (2006).</li>
<li>Weiner, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+challenge+of+multiple+sclerosis%3A+how+do+we+cure+a+chronic+heterogeneous+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Neurol%22%5BJournal%5D)">The challenge of multiple sclerosis: how do we cure a chronic heterogeneous disease.</a> Ann Neurol. 65, 239-248 (2009).</li>
<li>Fleming, J. O., Trousdale, M. D., Bradbury, J., Stohlman, S. A., Weiner, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+demyelination+induced+by+coronavirus+JHM+%28MHV-4%29%3A+molecular+identification+of+a+viral+determinant+of+paralytic+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Microb+Pathog%22%5BJournal%5D)">Experimental demyelination induced by coronavirus JHM (MHV-4): molecular identification of a viral determinant of paralytic disease.</a> Microb Pathog. 3, 9-20 (1987).</li>
<li>Totoiu, M. O., Nistor, G. I., Lane, T. E., Keirstead, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Remyelination%2C+axonal+sparing%2C+and+locomotor+recovery+following+transplantation+of+glial-committed+progenitor+cells+into+the+MHV+model+of+multiple+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Remyelination, axonal sparing, and locomotor recovery following transplantation of glial-committed progenitor cells into the MHV model of multiple sclerosis.</a> Exp Neurol. 187, 254-265 (2004).</li>
<li>Carbajal, K. S., Schaumburg, C., Strieter, R., Kane, J., Lane, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Migration+of+engrafted+neural+stem+cells+is+mediated+by+CXCL12+signaling+through+CXCR4+in+a+viral+model+of+multiple+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Migration of engrafted neural stem cells is mediated by CXCL12 signaling through CXCR4 in a viral model of multiple sclerosis.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 107, 11068-11073 (2010).</li>
<li>Hardison, J. L., Nistor, G., Gonzalez, R., Keirstead, H. S., Lane, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transplantation+of+glial-committed+progenitor+cells+into+a+viral+model+of+multiple+sclerosis+induces+remyelination+in+the+absence+of+an+attenuated+inflammatory+response%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Transplantation of glial-committed progenitor cells into a viral model of multiple sclerosis induces remyelination in the absence of an attenuated inflammatory response.</a> Exp Neurol. 197, 420-429 (2006).</li>
<li>Blakemore, W. F., Crang, A. J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBlakemore%2C+WF+%22Transplantation+of+glial+cells+into+areas+of+demyelination+in+the+adult+rat+spinal+cord%22">Transplantation of glial cells into areas of demyelination in the adult rat spinal cord</a>. , Oxford UP. Oxford. (1992).</li>
<li>Liu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+stem+cells+differentiate+into+oligodendrocytes+and+myelinate+in+culture+and+after+spinal+cord+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Embryonic stem cells differentiate into oligodendrocytes and myelinate in culture and after spinal cord transplantation.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 97, 6126-6131 (2000).</li>
<li>Keirstead, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+embryonic+stem+cell-derived+oligodendrocyte+progenitor+cell+transplants+remyelinate+and+restore+locomotion+after+spinal+cord+injury%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Human embryonic stem cell-derived oligodendrocyte progenitor cell transplants remyelinate and restore locomotion after spinal cord injury.</a> J Neurosci. 25, 4694-4705 (2005).</li>
<li>Mayor, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((First+patient+enters+trial+to+test+safety+of+stem+cells+in+spinal+injury%5BTitle%5D)+AND+%22BMJ%22%5BJournal%5D)">First patient enters trial to test safety of stem cells in spinal injury.</a> BMJ. 341, c5724-c5724 (2010).</li>
</ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

Um transplante bem executado vai depender principalmente na laminectomia cuidadoso e injeção das células. A armadilha primário para evitar durante uma laminectomia é o prejudicial da medula espinhal. Isso pode ocorrer durante o procedimento em si ou por danos causados ​​por fragmentos de ossos afiados deixado para trás após o procedimento. Para evitar essas, garantir que os pontos da tesoura curva micro são sempre de costas para o cabo e examinar cuidadosamente a espinha laminectomized para garantir que todos os fragmentos de ossos são limpos e que as bordas da estrutura remanescente vertebral não tem abertamente salientes ou irregulares. Como mencionado anteriormente, a detecção de efluxo será possível se a luz está brilhando e diretamente na medula espinal exposta durante a injecção. Efluxo é mais provável que isso aconteça com 30 agulhas (versus 33 gauge) e se a injeção é feita muito rapidamente. Embora este protocolo tem nos dado bons resultados, outros têm relatado mais períodos de espera (até 5 minutos) antes de retrair a agulha de injeção seguinte 8,9. Além disso, as agulhas bitola menor são preferíveis, mas temos observado que algumas células são facilmente lisadas quando passou por 33 agulhas. Para maximizar a eficiência, a equipe de transplante lotação as quatro estações diferentes (mouse prep, laminectomia, injeção, e suturas) é desejável. Além disso, o tempo para cada processo deve ser otimizado para minimizar o tempo as células estão esperando no gelo. Por exemplo, nós transplante de nossos ratos em grupos de quatro (o número de doses em cada carga da seringa), a pessoa injetar as células começa a carregar a seringa após o mouse terceiro foi laminectomized ea pessoa deve preparar os ratos anestesiar o seguinte grupo após o segundo rato do grupo anterior foi laminectomized. Desta forma, podemos transplante de células (ou controle de mídia) em 40 camundongos em cerca de 3 horas, apesar de cada rato terá aproximadamente 30-40 min. Terapias com células de substituição para o tratamento de algumas doenças do SNC estão actualmente em ensaios clínicos 10. Não há substituto para modelos in vivo de transplante e NSC nosso protocolo para o enxerto de NSCs na medula espinhal de ratos com desmielinização induzida viral facilita o uso de um modelo importante de MS e também pode ser facilmente adaptado para outros modelos.

<table border="1"><tbody><tr><th> Nome do reagente / equipamentos </th><th> Companhia </th><th> Número de catálogo </th><th> Comentários (opcional) </th></tr><tr><td> Ketaject </td><td> Parmaceuticals Phoenix </td><td> NDC 57319-542-02 </td><td></td></tr><tr><td> Cloridrato de xilazina </td><td> Biomedicals MP </td><td> 158307 </td><td></td></tr><tr><td> Nair </td><td> Church &amp; Dwight Co. </td><td></td><td></td></tr><tr><td>  10 mL Hamilton Seringa agulha w / Removable </td><td> Empresa Hamilton </td><td> 7635-01 </td><td></td></tr><tr><td> Agulhas Hamilton 30G, ou 33 G, ½ polegada, 30 ° chanfro </td><td> Empresa Hamilton </td><td> 7803-077803-05 </td><td> Testar a viabilidade de suas células após a passagem através de agulhas para identificar o melhor calibre para uso </td></tr><tr><td> Micro Tesoura </td><td> Precision Instruments mundo </td><td> 555500S </td><td></td></tr><tr><td> Pinça Graefe pequena </td><td> FST </td><td> 11053-10 </td><td></td></tr><tr><td> Estereotáxica </td><td> KOPF Instruments </td><td> Titular modelo 1772 Universal </td><td></td></tr><tr><td> Estereotáxica </td><td> KOPF Instruments </td><td> Modelo de suporte do eletrodo 1773 </td><td></td></tr><tr><td> Estereotáxica </td><td> KOPF Instruments </td><td> Modelo 902 estereotáxica de pequenos animais </td><td></td></tr><tr><td> Estereotáxica </td><td> KOPF Instruments </td><td> Modelo 960 transportadora eletrodo esquerdo </td><td></td></tr><tr><td> Suturas </td><td> Ethicon </td><td> 95057-064 </td><td></td></tr><tr><td> Lactato de Ringer </td><td> Hospira </td><td> NDC 0409-7953-03 </td><td></td></tr><tr><td> Staples </td><td> Ciência fina </td><td> 12032-07 </td><td></td></tr><tr><td> Hemostat </td><td> FST </td><td> 13010-12 </td><td></td></tr><tr><td> Bisturis, tamanhos 10,11 </td><td> Pescador </td><td> 268878, 268879 </td><td></td></tr><tr><td> Suturas </td><td> ETHICON </td><td> 1676G </td><td> tamanho 5-0, 3 / 8 &quot;círculo, agulha de 19mm, fio trançado 45 centímetros </td></tr><tr><td> Reflex 7 aplicador de clipe ferida </td><td> FST </td><td> 12031-07 </td><td></td></tr><tr><td> 7 milímetros Reflex clips ferida </td><td> FST </td><td> 12032-07 </td><td></td></tr><tr><td> Olsen-Hegar porta-agulha </td><td> FST </td><td> 12502-12 </td><td></td></tr></tbody></table>

transplante de células-tronco cirúrgica do rato neural na medula espinhal de camundongos infectados com o vírus da hepatite neurotrófico rato

Surgical Transplantation of Mouse Neural Stem Cells into the Spinal Cords of Mice Infected with Neurotropic Mouse Hepatitis Virus

Camundongos infectados com a cepa JHM neurotrópica do mouse vírus da hepatite (MHV) Desenvolver resultados patológicos e clínicos semelhantes aos pacientes com a doença desmielinizante Esclerose Múltipla (MS). Nós mostramos que o transplante de NSCs na medula espinhal de ratos doentes resultados em uma melhora significativa em ambos os remielinização e no resultado clínico. Terapias com células de substituição para o tratamento de doenças neurológicas crônicas são agora uma realidade e em modelos in vivo são vitais para a compreensão das interacções entre as células enxertadas e microambiente tecido hospedeiro. Esta apresentação fornece um método adaptado para o transplante de células na medula espinhal de ratos infectados JHMV. Em resumo, nós fornecemos um procedimento para i) preparação de NSCs antes do transplante, ii) pré-operatório de ratos, iii) a exposição da medula espinhal através de laminectomia, iv) a injeção estereotáxica de NSCs, e iv) cuidados pós-operatórios .

O transplante de células-tronco do mouse neural (NSCs) na medula espinhal de ratos com desmielinização estabelecida é detalhado. A preparação de NSCs, a laminectomia de vértebra torácica 9 (T9), e transplante de NSCs é descrito juntamente com os cuidados pré e pós-operatório dos ratos.

Transplante de Células-Tronco cirúrgica do rato Neural na medula espinhal de camundongos infectados com o vírus da Hepatite neurotrófico rato

Camundongos infectados com a cepa neurotrópica JHM do vírus da hepatite murina (MHV) desenvolvem desfechos patológicos e clínicos semelhantes aos de pacientes com a ...

O objetivo geral deste procedimento é promover a remielinização e a melhora clínica em animais com desmielinização estabelecida por meio do transplante de células-tronco neurais na medula espinhal de camundongos infectados com JHMV. Isso é realizado primeiramente preparando o animal. O segundo passo do procedimento consiste em realizar uma laminectomia nas vértebras torácicas.Em seguida, 10 células são injetadas na medula espinhal exposta. Após uma injeção bem-sucedida, o ferimento é fechado. Por fim, a presença de células-tronco neurais de camundongo na medula espinhal.O parênquima pode ser visualizado por métodos como microscopia fluorescente, transplante de células-tronco neurais na medula espinhal de JHMB. Camundongos infectados podem ajudar a responder perguntas fundamentais no campo das terapias de substituição celular para o tratamento de doenças desmielinizantes, como a forma como as células migram, proliferam e se diferenciam, além de como afetam o sistema nervoso central. E se podemos modificar as células ou o ambiente da medula espinhal para o qual são transplantadas, a fim de potencializar seus benefícios terapêuticos.Embora este método possa fornecer informações sobre a terapia de substituição celular em um modelo viral de desmielinização, ele também pode ser aplicado a outros modelos de desmielinização e lesão, como encefalomielite autoimune experimental, EAE, e lesão medular. Antes de preparar as células para injeção, prepare todas as soluções necessárias. Em seguida, limpe e esterilize todo o equipamento.Prepare a área cirúrgica e configure o micromanipulador para preparar as células para o transplante de olhos com tripsina e, em seguida, re-suspenda-as em um frasco cônico de 50 mililitros. Lave as células a serem transplantadas três vezes em HBSS. Conte as células antes da centrifugação final.Após a última centrifugação, decante o HBSS e deixe o frasco em posição invertida para evitar que gotículas atinjam o pellet. Seque as paredes internas com um lenço Kim estéril irradiado com UV. Não permita que o pellet seque.Mantendo o tubo na posição vertical lentamente e com muita delicadeza, re-suspenda as células na metade do volume final desejado de HBSS. Em última instância, as células devem estar numa concentração de 100.000 células por microlitro.Meça o volume total pipetando a suspensão em uma ponta de pipeta e, em seguida, ajuste o seletor da pipeta até que toda a suspensão esteja dentro da ponta. Isso indicará quanto HBSS adicional é necessário para a concentração desej combustível. Complete o volume celular até o volume desejado.Adicionando HBSS. Você pode transferir as células para um tubo eppendorf. Coloque-as novamente no gelo.Verifique a viabilidade das células se elas precisarem permanecer em gelo por mais de duas horas. Para iniciar o procedimento cirúrgico, confirme o nível adequado de anestesia por meio do reflexo de pinçamento do dedo do pé. Use tesouras elétricas para raspar a região dorsal do camundongo, desde a parte inferior das costas até o pescoço.Após a área ser depilada, aplique uma camada fina de creme depilatório para remover qualquer pelos remanescentes. Após um a dois minutos, limpe a área com gaze seca e, em seguida, com gaze levemente embebida em água com sabão. A área cirúrgica agora deve estar livre de pelos.Por fim, esterilize a área preparada com solução de Betadine e aplique pomada nos olhos. Para evitar ressecamento, posicione o camundongo em decúbito dorsal. Faça uma incisão no local da laminectomia, estendendo-se aproximadamente a partir das vértebras torácicas.T oito a T 11. Exagere a curvatura da coluna vertebral e localize T 10. É a primeira vértebra com um processo plano e geralmente está duas vértebras cranianas ao ápice da curvatura da coluna vertebral.Com a pinça cinza, segure firmemente a coluna vertebral. No nível de T9, use um bisturi para fazer um corte no espaço entre as duas projeções espinhosas de T10 e T11. Em seguida, raspe a camada muscular para expor o osso subjacente, certificando-se de que a curvatura da tesoura esteja voltada para longe da medula.Insira lentamente uma lâmina da tesoura entre T10 e T11. Deslize a lâmina entre o cordão e o pedículo de T10 e corte o pedículo. Repita do outro lado. Levante a lâmina para expor o cordão por baixo e corte-o cuidadosamente.Certifique-se de não deixar para trás nenhum fragmento ósseo solto ou irregular. Depois que todos os fragmentos ósseos forem removidos, limpe qualquer sangue com cotonetes estéreis. Primeiro, prepare a seringa Hamilton fixando a agulha com a porca da agulha.Insira o êmbolo e enxágue várias vezes com água. Limpe uma vez com etanol 70% e HBSS. Remova o êmbolo e solte a porca da agulha.Puxe a agulha para longe da seringa para evitar pressão contrária. Ao carregar as células, carregue 15 microlitros de células na seringa pressionando firmemente a ponta da pipeta contra a parte traseira da seringa. Insira o êmbolo cerca de cinco milímetros e, em seguida, aperte a porca da agulha.Pressione o êmbolo até que parte da suspensão celular seja vista saindo pela agulha. Certifique-se de que não haja bolhas na seringa e deite a seringa horizontalmente para evitar que as células formem um gradiente por ação da gravidade. Retornando ao animal, use hemostatos para segurar o músculo espinhoso S.Conectando as espinhas de T oito e T nove. Prenda o hemostato ao braço esquerdo do micromanipulador de forma que as patas dianteiras do camundongo fiquem no ar e suas patas traseiras toquem levemente uma plataforma de papel toalha estéril.Fixe a seringa ao braço direito do micromanipulador em um ângulo de 70 graus e deslize a seringa para a posição mais baixa possível antes de apertar o grampo. Estabilize o camundongo fixando sua cauda contra as toalhas de papel. Abaixe lentamente a agulha em direção à medula espinhal.Insira a ponta um milímetro dentro do hemisfério oposto através da linha média dorsal. A ponta da agulha deve estar na substância cinzenta ou próxima, mas não no canal central. Injete lentamente 2,5 microlitros de células a uma taxa de um microlitro a cada cinco segundos.Após injetar as células, aguarde 10 segundos e retire a agulha. Um décimo de volta. Retire nesse ritmo a cada 10 segundos até que a agulha saia do cordão.Injetar as células muito rapidamente ou remover a agulha muito depressa pode causar fluxo da suspensão celular. Se isso ocorrer, descarte o camundongo do estudo. Após removê-lo do cordão, recolha rapidamente a agulha e desconecte a seringa do braço do micromanipulador.Novamente, coloque-o na posição horizontal. Solte o mouse e transfira-o para uma mesa de sutura. Repita este procedimento para cada mouse até que a seringa esteja vazia.Descarte as células e recarregue se houver aglomeração visível, lavando e limpando a seringa entre os carregamentos. Após a injeção, o animal é transferido para um local separado para ser suturado. Passe a agulha de sutura pela fáscia superficial em ambos os lados da incisão.Puxe a sutura para unir a fáscia e cobrir a medula espinhal exposta no local da lâmina removida. Use um porta-agulhas em pinça para dar três nós e corte o máximo possível do fio. Uma sutura geralmente é suficiente enquanto se afasta a pele do camundongo.Para evitar grampear o músculo subjacente, feche a incisão com dois a três grampos. Uma vez que a ferida esteja fechada, injete 0,5 mililitros de solução de Ringer lactato subcutaneamente na região lombar, mas distante da incisão. Coloque o camundongo de lado em sua gaiola, certificando-se de que o local da cirurgia não entre em contato com a cama da gaiola.Monitore os animais até a recuperação completa. Esta imagem mostra células-tronco neurais de camundongo marcadas com GFP transplantadas com sucesso em uma seção coronal da medula espinhal. 21 dias após o transplante.Depois de assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa ideia de como transplantar células-tronco neurais na medula espinhal de camundongos infectados com JHMV. Uma vez dominada, é possível realizar esta técnica em 40 camundongos em cerca de três horas.

surgical-transplantation-mouse-neural-stem-cells-into-spinal-cords

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociência

Transplante precursoras neurais é uma estratégia promissora para a proteção e / ou substituição perdido / cervical disfuncional neurônios motores frênicos em lesão medular (SCI) e do neurônio motor doença, a esclerose amiotrófica laterais (ALS). Nós fornecemos um protocolo para entrega celular para chifre da medula espinhal cervical ventral em modelos de roedores da ALS e SCI.

Intra Transplante de Células de Segmentação Chifre Cervical Ventral em Esclerose Lateral Amiotrófica e lesão medular traumática

Fonte: Weber, R. Z., et al. Transplante intracerebral e rastreamento de bioluminescência in vivo de células progenitoras neurais humanas no cérebro de camundongos. J. Vis. Exp. (2022)Este vídeo demonstra o transplante estereotáxico de células progenitoras neurais humanas geneticamente modificadas (NPCs) para o cérebro de camundongos. Os pesquisadores injetam NPCs que expressam luciferase e proteínas fluorescentes, permitindo imagens de bioluminescência in vivo e microscopia de fluorescência...

Transplante de células progenitoras neurais humanas no cérebro de camundongos

Fonte: Furmanski, O., et al. Modelo de Impacto Cortical Controlado de Lesão Cerebral de Camundongo com Transplante Terapêutico de Células Neurais Derivadas de Células-Tronco Pluripotentes Induzidas por Humanos. J. Vis. Exp. (2019)Neste vídeo, células neurais derivadas de células-tronco pluripotentes induzidas por humanos são injetadas estereotaxicamente na borda da substância cinzenta e da substância branca do córtex profundo em um modelo de camundongo de lesão cerebral traumática. As células...

Transplante Estereotáxico de Suspensão de Células Neurais em um Camundongo com Lesão Cerebral Traumática

Este vídeo demonstra a entrega intranasal de células-tronco neurais terapêuticas carregadas de vírus oncolíticos em um modelo de camundongo portador de tumor cerebral. A administração intranasal não invasiva de células-tronco contorna a barreira hematoencefálica, facilitando sua entrega ao local do tumor no cérebro para aplicações terapêuticas.

Entrega intranasal de células-tronco neurais terapêuticas (NSCs) em modelo murino: um procedimento para entrega direcionada a tumor de NSCs carregadas com vírus oncolítico em modelo de camundongo portador de tumor cerebral

Fonte: Parajuli, B., et.al. Transplante de microglia derivada de células-tronco pluripotentes induzidas por humanos no cérebro de camundongos imunocompetentes por via transnasal não invasiva. J. Vis. Exp. (2022).Este vídeo demonstra o transplante transnasal de células da microglia humana derivada de células-tronco pluripotentes induzidas (iPSMG) em um cérebro de camundongo. A hialuronidase é aplicada nas narinas de um camundongo com depleção microglial para aumentar a permeabilidade. A...

Transplante Transnasal de Células Microgliais Humanas Derivadas de Células-Tronco Pluripotentes Induzidas no Cérebro de Camundongos

Aqui, apresentamos um novo modelo de fígado de camundongo humanizado gerado em camundongos knockout celular mediado por receptor de toxina Alb (TRECK)/SCID após o transplante de células-tronco hepáticas humanas imaturas e expansíveis.

Geração de um humanizado rato Liver Usando células-tronco hepáticas humanas

As células estaminais são portadores terapêuticos promissores para tratar tumores cerebrais devido ao seu tropismo intrínseco de tumor. A entrega de células estaminais intranasais não invasivas ultrapassa a barreira hematoencefálica e demonstra um forte potencial de tradução clínica. Este artigo resume os princípios básicos da administração de células estaminais intranasais em um modelo de glioma de mouse.

Entrega intranasal de células-tronco terapêuticas para Glioblastoma em um modelo de mouse

Descrevemos um protocolo para a realização de hepatectomy parcial (PHx) e transplante de células através do baço em NOD. SCID (ASSENTIMENTO. CB17-Prkdcscid/J) ratos. Neste protocolo, uma incisão é feita para expor e fazer a ressecção do lobo esquerdo do fígado seguido por outra incisão para o transplante intrasplenic de células.

Intrasplenic transplante de hepatócitos após Hepatectomy parcial na NOD. Ratos SCID

Descrevemos o transplante intraparenquimal de células progenitoras neurais transduzidas com um vetor de repórter duplo expressando proteína fluorescente verde-luciferase (GFP) no cérebro do camundongo. Após o transplante, o sinal de luciferase é repetidamente medido usando bioluminescência in vivo e células enxertadas expressas por GFP identificadas em seções cerebrais usando microscopia de fluorescência.

Transplante intracerebral e rastreamento de bioluminescência in vivo de células progenitoras neurais humanas no cérebro do camundongo

O protocolo aqui apresentado permite o transplante de microglia humana derivada de células-tronco pluripotentes induzidas (iPSMG) no cérebro através de uma rota transnasal em camundongos imunocompetentes. O método de preparação e transplante transnasal das células e a administração da mistura de citocinas para a manutenção do iPSMG é mostrado.

Transplante de Microglia Pluripotente Pluripotente Induzido Humano em Microglia De camundongos imunocompetentes através da Rota Transnasal Não Invasiva

O presente protocolo descreve o desenvolvimento de um modelo murino reprodutível de glioma medular por meio da injeção de células tumorais no espaço intervertebral, oferecendo uma abordagem mais eficaz e menos invasiva para pesquisa e desenvolvimento terapêutico.

Transplante cirúrgico de células tumorais na medula espinhal de camundongos

Aprenda o transplante cirúrgico de células-tronco neurais na medula espinhal de camundongos infectados com JHMV para promover remielinização. Este método viabiliza estudos de terapias de reposição celular em doenças desmielinizantes.

Transplante de Células-Tronco cirúrgica do rato Neural na medula espinhal de camundongos infectados com o vírus da Hepatite neurotrófico rato (Vídeo) | JoVE Journal

Transplante de Células-Tronco cirúrgica do rato Neural na medula espinhal de camundongos infectados com o vírus da Hepatite neurotrófico rato

Explorar mais vídeos