GABA corrientes activadas de un solo canal y Tonic en rodajas de cerebro de rata

El objetivo general del siguiente experimento es registrar las corrientes activadas por GABA generadas por moléculas individuales, la corriente de un solo canal y por poblaciones específicas de canales ubicados en las sinapsis o fuera de las sinapsis. Esto se logra preparando primero rodajas de cerebro de rata hipocampal y haciendo pipetas que se utilizarán para la sujeción del parche. Como segundo paso, se coloca una pipeta en la membrana neuronal.

Después de la formación de un sello giga, se obtiene la configuración de abrazadera de parche adjunta a la celda. A continuación, aplique la succión a la pipeta. Una vez que irrumpe en la célula, se establece toda la configuración de la abrazadera del parche de la célula.

Se obtienen resultados que diferencian entre canales gabaa sinápticos y extrasinápticos. La principal ventaja de la técnica de pinza para mascotas junto con los métodos existentes como la emisión es que se estudian las propiedades funcionales de los canales. El método de la pinza de parche puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la neurociencia, como qué determina la aceptabilidad de las neuronas y cómo se modula y afina.

Las implicaciones de esta tecnología se extienden hacia la terapia y el diagnóstico de muchas enfermedades porque cada célula viva depende del funcionamiento adecuado del canal iónico para la supervivencia y la función celular especializada. Para comenzar este procedimiento, sacrifique una rata wistar postnatal de 16 a 22 días de edad por decapitación y extraiga rápidamente el cerebro con una espátula. Corta el cerebro a lo largo de la línea media con una cuchilla quirúrgica.

A continuación, coloque cada hemisferio sobre un papel de filtro watman con una superficie cortada frente al papel. Ponga una gota de superpegamento en el disco de muestra y coloque la semiesfera encima con una superficie de corte hacia abajo. A continuación, coloque el disco de muestra en la cámara de corte del vibrador que está llena de hielo frío.

Un líquido cefalorraquídeo. Establezca el grosor de la rebanada en 400 micrómetros y comience a cortar el cerebro. Corta aproximadamente dos milímetros de tejido cerebral hasta llegar al hipocampo.

A continuación, coloque las rodajas del hipocampo en una placa de Petri de vidrio llena de un líquido cefalorraquídeo. La placa se coloca sobre un fondo negro para permitir una fácil visualización del hipocampo. El siguiente paso es aislar el hipocampo del tejido circundante con una cuchilla quirúrgica afilada.

Tenga cuidado de no empujar o tirar del pañuelo después de eso. Incube las rodajas y la solución de líquido cefalorraquídeo A 37 grados centígrados durante una hora, y luego manténgalas a temperatura ambiente hasta que finalicen los experimentos. Para las pipetas de parche se utilizan capilares de vidrio de silicato Boro.

Tire de las pipetas de parche con un extractor de pipetas automatizado o manual, lo que da como resultado una resistencia de dos a cuatro mega ohmios para grabaciones de celda completa, o de ocho a 20 mega ohmios para grabaciones de un solo canal. Pula la pipeta con el mismo cristal de silicato de boro para la grabación de un solo canal. Con una micro forja, derrita el vidrio de silicato de boro en el alambre de platino para suavizar la punta.

Al pulir las pipetas de esta manera, se crean pipetas que forman sellos más estables y resistentes en comparación con las pipetas pulidas por el calor de un alambre sin recubrimiento o mediante un paso de pulido en el extractor automático. El equipo de pinza de parche consta de un microscopio en una mesa flotante y encerrado en una jaula de Faraday, un amplificador, un digitalizador y una computadora. Juntos, estos equipos a menudo se denominan equipo de sujeción de parche.

Ahora inserte una pipeta en el soporte de la pipeta y apriete la tapa para sujetar la pipeta. La abrazadera P se utiliza como software de sujeción de parches. Ajuste el amplificador de pinza OC 200 B a V clamp, ganado a dos, filtro a dos kilohercios y el potencial de retención a cero milivoltios para crear una presión positiva en el aire de soplado de la pipeta en la boquilla que está conectada al tubo que se conecta al soporte de pipeta.

A continuación, cierre la válvula entre la boquilla y el tubo. Asegúrese de que no haya fugas de aire. A continuación, sumerja la pipeta en la solución de baño.

En la pantalla del ordenador donde se mide la resistencia de la pipeta, verá un pulso generado por un tren de pulsos de cinco milivoltios y un número que indica la resistencia de la pipeta. Los números más pequeños representan aberturas de punta de pipeta más grandes y pipetas más grandes. Ajuste el desplazamiento de la pipeta en el amplificador a cero.

Utilice un aumento de 10x en el microscopio para identificar la región, o un aumento de 60x. Para identificar una neurona parametálica que se va a parchear en las rodajas del hipocampo, las células granulosas del giro dentado, la región del cuerpo de una célula parametálica CA y la región del cuerpo de la célula CA tres parametálicas aparecen cada una como una banda brillante. Coloque la pipeta en enfoque para que pueda ver tanto la región o la célula como la pipeta.

Cuando mire a través de los oculares del microscopio, coloque la pipeta por encima del centro de la región utilizando el ajuste del manipulador de movimiento grueso y baje la pipeta hasta que esté justo por encima, pero tocando el tejido. En este punto, baje la pipeta muy suavemente sobre el centro de la célula o región utilizando los ajustes de movimiento fino del manipulador. Al mismo tiempo, observe la pantalla de la computadora para realizar un seguimiento de la resistencia de la pipeta.

Siga bajando la pipeta hasta que la resistencia de la pipeta sea mayor. Libere la presión positiva de la pipeta abriendo la válvula. Esto crea una succión suave y forma automáticamente el sello giga.

Si no se forma el sello giga, aplique succión a la boquilla donde anteriormente aplicó presión positiva. Ahora ha obtenido la llamada configuración de abrazadera de parche conectada a la celda. Ajuste la compensación de capacitancia rápida y lenta para cancelar el transitorio procedente de la pipeta y del soporte de la pipeta.

En la pantalla de la computadora, verá un rastro de corriente plana. Cuanto mayor sea el valor de GigE, mejor será la relación señal/ruido que tendrá en las grabaciones de un solo canal para grabar corrientes de un solo canal con una configuración de abrazadera de parche conectada a la celda. Establezca la ganancia en 500 y la frecuencia de muestreo de datos en no menos de 100 microsegundos.

A continuación, registre las corrientes. Mantenga el volumen de la solución de baño bajo de modo que solo cubra la rebanada para minimizar el ruido en las grabaciones para realizar la grabación de toda la celda. Cambie el potencial de la pipeta a menos 60 milivoltios o cerca del potencial de membrana en reposo.

En la configuración de celda conectada, aplique succión a la pipeta a través del tubo que está conectado al soporte de pipeta. Al mismo tiempo, observe los cambios en la resistencia y el transitorio de capacitancia en la pantalla de la computadora. Una vez que hayas irrumpido en la celda.

Cuando esto sucede, se encuentra en la llamada configuración de celda completa o modo de celda completa. Deje que la solución de pipeta se equilibre con el interior de la célula durante cinco a 10 minutos. Mientras tanto, realice un seguimiento del valor de la resistencia de la serie.

La corriente es transportada por las poblaciones de canales abiertos en la membrana celular. Para demostrar la activación de canales individuales de GABA, se añade GABA a la solución de pipeta, ya que no puede atravesar la membrana celular. Aquí se muestran las corrientes de un solo canal activadas por una concentración de GABA de 20 nanomolares en un parche unido a la célula en una neurona granulosa de giro dentado.

El parche se despolarizó en 40 milivoltios. La conductancia máxima del canal fue de 44 Picos de semen y su latencia de activación fue de 2,63 minutos. Aquí hay un ejemplo de cómo diferenciar las corrientes gaba, sinápticas y extrasinápticas activadas por la naturaleza fásica y tónica de las corrientes.

La corriente a través de las poblaciones de canales se registró de las neuronas del hipocampo de rata utilizando el método de pinza de voltaje de toda la célula para identificar las corrientes tónicas y fásicas. Se aplicaron 100 micromolares del antagonista de gabaa SR 9 55 31 a una neurona del giro dentada como se indica en BA y a una ca tratada con insulina. Una neurona parametálica, como se indica en BB SR 9 55 31, bloqueó los canales sinápticos adicionales e indujo un cambio en la corriente de referencia, que reveló la corriente tónica.

Una vez dominado, se puede hacer en dos minutos obtener un parche adjunto a la celda y luego irrumpir en la celda para establecer un parche de celda completa. Después de este procedimiento, se pueden parchear otros tejidos como ojales pancreáticos intactos o células aisladas como linfocitos o células en cultivo.