Подготовка Качество Инозитол пирофосфаты

Общая цель этой процедуры заключается в получении и очистке высококачественного ноолпирофосфата. Это достигается путем использования IP 6 в качестве субстрата для киназы IP 6, одного фермента для генерации IP 7. Далее ферментативные реакции загружаются на полиамидный гель и полоса, соответствующая IP 7, иссекается.

Затем семерка IP изолируется с помощью последующих циклов дегидратации. Завершающим этапом процедуры является подтверждение чистоты продукта и определение концентрации. В конечном счете, могут быть получены результаты, показывающие биологическую активность IP 7 путем инкубации IP 7.

При использовании киназы VIP one и при использовании фосфатазы IP seven DDP one эти реакции приводят к образованию IP 8 и IP 6 соответственно. Сделайте это, Met может дать представление о сигнализации IP seven. Он также может быть применен к другим системам, таким как часть фосфатов, таких как IP 8 или IP 5, производный PPIP 4.

Этот протокол начинается с приготовления ферментативных реакций, в которых IP шесть киназ один или VIP один превращают IP 6 в изоформы, связанные с пирофосфо. Для этой демонстрации ферменты, помеченные гистамином IP 6, киназой 1 и GST меченными VIP one, были очищены от кишечной палочки в соответствии с ранее описанной процедурой. Для начала подготовьте от 10 до 20 независимых ферментативных реакций, содержащих IP 6 и его IP шесть киназ один или GST VIP один, как описано в письменном протоколе.

Отрегулируйте объем до 50 микролитров с помощью дважды дистиллированной воды milli Q. После кратковременного вращения трубочек инкубируйте реакции при температуре 37 градусов Цельсия в течение ночи с вращением. Приготовьте аппарат из полиакриламидного геля, используя стеклянные пластины длиной 24 сантиметра, шириной 18 сантиметров, пространством шириной 1,5 миллиметра и 16-полосным гребнем.

Далее между предварительно отлитыми стеклянными пластинами наливают заранее приготовленный раствор геля в объеме 50 миллилитров на гель. Вставьте расческу и дайте гелю полимеризоваться в течение 30-60 минут при комнатной температуре. Как только гель полимеризуется, перенесите аппарат в холодильную камеру.

Предварительно запустите гель в один раз TBE в течение примерно 30-60 минут при напряжении от 200 до 300 вольт, в то же время нанесите оранжевый G-краситель. Для каждой реакции готовят стандартный контрольный образец, содержащий два моля IP шесть. После предварительного запуска тщательно промойте каждую лунку с помощью проточного буфера.

С помощью шприца, прикрепленного к игле 21 калибра, удалите осадок. Затем загрузите образцы в гель, избегая нагружения первых двух и последних двух дорожек геля. Наконец, запустите гель на ночь со скоростью семь миллиампер на гель, пока оранжевая полоса красителя G не окажется в пределах последних 10 сантиметров от дна геля.

Чтобы начать выделение IP seven, разберите гелевый аппарат и аккуратно снимите одну стеклянную пластину, оставив гель на другой. Отрежьте небольшую часть геля от чуть выше оранжевой полосы GD до низа, включая шесть стандартных и одну полосу образцов. Снесенную часть геля окрасьте толуидиновым синим в течение нескольких минут, пока не появится полоса Анатола Пирофосфата.

Тем временем поместите ранее снятую стеклянную пластину обратно поверх геля, чтобы предотвратить высыхание неокрашенного геля. Перенесите окрашенную часть геля в раствор для окрашивания DES на несколько минут, чтобы смыть избыток толуидинового синего, затем переместите гель с неокрашенным гелем. Должен быть виден седьмой диапазон IP, так как он работает немного медленнее, чем стандартный IP шесть A TP, который работает быстрее, чем IP шесть.

Затем с помощью бритвенного лезвия разрежьте полосу IP семь на неокрашенной части геля. Используйте миграционное положение IP seven, определенное с помощью окрашивающего геля. Чтобы оценить расположение полосы IP seven, поместите вырезанную из геля полосу IP seven в пробирку объемом 15 миллилитров и добавьте 10 миллилитров воды двойной дистилляции milli Q.

Вращайте пробирки в течение 10 минут при комнатной температуре после инкубации, выбросьте жидкость путем сцеживания, чтобы удалить избыток клеточного энцефа и микроскопические частицы акриламида. Затем выполните два цикла дегидратации, сначала добавив пять миллилитров 50% метанола в тюбик, содержащий гель IP seven. Поворачивайте образец при комнатной температуре в течение двух часов.

Затем переложите срез геля в новую 15-миллилитровую пробирку, содержащую пять миллилитров дважды дистиллированной воды milli Q, и вращайте при комнатной температуре в течение двух часов. Сохраните пробирку, содержащую метанол, для дальнейшего использования после инкубации. Повторите цикл дегидратации еще раз, чтобы сконцентрировать элюированную семерку.

Соедините ранее добавленные пять миллилитров воды и пять миллилитров 50%-ного метанола. Высушите комбинированный раствор с помощью скоростного пылесоса, нагретого до 60 градусов Цельсия. Когда образцы почти высохнут, переложите оставшуюся жидкость в центрифужную пробирку объемом 1,5 миллилитров.

Вращайте трубку в течение двух минут по 5 000 оборотов в минуту. Соберите натант SUP, оставив на дно от 20 до 30 микролитров, так как в нем могут содержаться частицы акриламида. Переложите образец в свежую центрифужную пробирку объемом 1,5 миллилитров.

При необходимости продолжайте процесс сушки с помощью необогреваемого скоростного пылесоса. Восстановление IP семь значительно снижается, если образцы полностью высыхают. Поэтому обязательно нужно прекращать процесс сушки, когда образцы достигнут объема от 100 до 300 микролитров.

После того, как изолированный IP 7 будет восстановлен, загрузите от двух до пяти микролитров образца на страницу геля, чтобы определить его концентрацию и чистоту. Загрузить несколько разбавлений IP шесть в качестве норм концентрации и четыре моля маркера полипов. После запуска геля визуализируйте исходные изоформы пирофосфата путем окрашивания и окрашивания всего геля раствором толуидинового синего.

Следуя только что описанной процедуре после окрашивания толуидином, концентрации могут быть определены путем сканирования геля и сравнения различий в интенсивности между IP 6 и IP 7. С помощью программного обеспечения для визуализации, такого как Image J, осуществляется препаративное ферментативное преобразование IP 6 в IP 7. Использование ферментов IP 6 киназы один и VIP 1 может быть легко решено с помощью анализа страницы.

Загрузка IP six в качестве контроля размера вместе с окрашиванием гелем толуидинового синего позволяет идентифицировать пирофосфорилированные производные. Поскольку они работают медленнее, в зависимости от количества фосфатных групп, присутствующих на исходной основе, описанная выше процедура привела к легкой очистке IP семь. Кроме того, анализ очищенного анатольпирофосфата по страницам показал чистоту IP seven.

Интересно, что один три пирофосфатных IP-5 изомер продукта IP 7 из VIP 1 мигрирует немного медленнее, чем пятипирофосфатный IP-5 изомер VIP 7, который генерируется IP шесть киназы один. Использование стандартов IP six позволяет легко количественно определить концентрацию очищенного IP 7 перед использованием IP 7. Для дальнейших экспериментов можно оценить его биологическую активность. Пять.

Пирофосфат IP 5 инкубируется с FIP 1 и с фосфатазой IP 7 DDP один в обычном режиме. Очищенный IP семь преобразуется в IP 8 для VIP One и в IP 6 для DDP one. После этой процедуры могут быть выполнены другие методы, такие как длительное окрашивание толином в синий цвет, чтобы ответить на дополнительные вопросы, такие как выделение восьми IP или других фосфорилированных в изоформных формах.