Trasplante de células madre de Estrategias para la restauración de la disfunción cognitiva causada por la radioterapia craneal

El objetivo general del siguiente experimento es trasplantar células madre de forma reproducible en el hipocampo. En primer lugar, las ratas atímicas se someten a radioterapia estereotáctica, simulando lo que podría ocurrir durante el tratamiento clínico del cáncer cerebral. En el laboratorio, las células madre neurales humanas se cultivan para trasplante, generalmente se requieren 1 millón de células para el tratamiento de una sola rata.

Dos días después de la irradiación, las células madre se inyectan lentamente en el hipocampo en un lugar preciso. En última instancia, el protocolo muestra la migración de las células madre trasplantadas a través del hipocampo. La primera vez que tuve la idea de estas metodologías fue cuando comencé a considerar las posibilidades de usar células madre para revertir la inhibición de la neurogénesis después de la irradiación craneal, en general, las personas que conocían este método tendrán dificultades porque el crecimiento de las células madre no es trivial y requiere atención y cuidado diarios en condiciones de crecimiento sin antibióticos.

La demostración visual de este procedimiento desmitificará el proceso clínico utilizado para la reconstrucción de imágenes para la irradiación precisa de volúmenes cerebrales pequeños y bien definidos. El Dr. Dante Rowa, profesor clínico de mi departamento, demostrará el procedimiento de irradiación. La preparación de las células madre será demostrada por la Sra. Mary Land y Catherine Tran, técnicas en mi laboratorio, y el Dr. Muja, un becario postdoctoral, demostrará los procedimientos necesarios para el trasplante.

Utilizamos software de radioterapia guiada por imágenes para el posicionamiento preciso de los animales antes del tratamiento y radioterapia modulada para la irradiación dirigida con un daño mínimo por radiación a otras partes del cerebro. 24 horas después de una resonancia magnética, genere otro volumen de imagen transversal colocando al animal sedado en un escáner de tomografía computarizada de oncología radioterápica. Coloque la rata en la misma posición que se utilizó para la resonancia magnética y configure la unidad de TC para escanear la región del cráneo y generar los datos de planificación del tratamiento de la TC.

Obtenga 106 imágenes de TC con un grosor de imagen de 0,8 milímetros. A continuación, transfiera los datos de las imágenes de resonancia magnética y tomografía computarizada al software de planificación del tratamiento Eclipse. Utilice eclipse para fusionar los datos de la resonancia magnética y la tomografía computarizada en función de la anatomía ósea y la compatibilidad de los tejidos blandos.

Este es un paso variable en el tiempo y, dependiendo de la calidad de la imagen, este proceso puede tardar de una a tres horas. Una vez obtenida una fusión de imagen satisfactoria, se contornean las regiones objetivo que se van a irradiar, así como los órganos críticos adyacentes. La irradiación puede administrarse a todo el cerebro o restringirse a regiones volumétricas específicas, como los hipopótamos individuales.

Los contornos proporcionan no solo la ubicación de estos órganos, sino también información sobre el volumen que será fundamental para adaptar la distribución de la dosis. Para adaptar la distribución de la dosis. Introduzca información sobre la dosis objetivo, la conformidad del objetivo y las restricciones de dosis para los órganos críticos en la ventana de optimización de dosis en eclipse.

Una vez que se genera un plan, eclipse proporciona la dosis calculada superpuesta a las imágenes axiales coronales y sagitales, así como en formato de histograma de volumen de dosis. Es en este punto cuando se debe evaluar el plan para determinar si es apto para su entrega o necesita ser mejorado. Para comenzar el proceso de irradiación, coloque una rata sedada debajo de una manta de papel para mantenerla caliente.

Pasados unos minutos, coloque la rata en la mesa de tratamiento del acelerador lineal de radioterapia cubierta con la manta, pero con el cráneo al descubierto. Asegúrese de colocarlo en la misma posición que se utilizó para generar la tomografía computarizada. Este paso es fundamental para garantizar la precisión en la administración de la dosis.

A continuación, adquiera imágenes de rayos X ortogonales de las ratas sedadas utilizando el sistema de imágenes a bordo en el acelerador lineal de radioterapia, corregistre las imágenes de rayos X ortogonales en un conjunto de imágenes de referencia proporcionado por Eclipse y proceda a aplicar las correcciones de posición necesarias para una alineación adecuada de la imagen. Administre la irradiación como una dosis de 10 grados con un plan IMRT de seis campos para un solo hipocampo y con un plan de arco rápido de dos arcos para la irradiación de ambos hipopótamos. Una vez completada la administración del tratamiento, retire la envoltura de la sala de tratamiento y permita que se recupere en una jaula de retención con calefacción.

Para prepararse para la cirugía, use maquinillas eléctricas para quitar el pelaje de la cabeza de una rata A TN anestesiada. Limpie el área afeitada con aplicaciones repetidas de povidona yodada y etanol al 70% trabajando dentro de una campana de flujo laminar. Prepare los instrumentos estereotáxicos, el taladro micromolar, el esterilizador de lecho seco y los controladores.

Mantenga al animal caliente durante la cirugía colocándolo sobre una superficie caliente. Se usan guantes estériles antes y durante la cirugía y se rocían con etanol al 70%. El equipo quirúrgico se mantiene en una campana de flujo laminar dedicada.

Para mantener las condiciones asépticas, cubra al animal con un pequeño paño quirúrgico de modo que solo quede expuesta la cabeza. Coloque la cabeza del animal firmemente dentro del marco estereotáxico insertando barras en la oreja en el atu auditivo externo. Tenga mucho cuidado al deslizar la punta de la barra de aire en el canal auditivo.

Coloque la barra de incisivos enganchando los incisivos superiores de la rata y ajustando la altura de la barra al punto de referencia estándar. A continuación, apriete la pinza nasal. Centre la posición de la cabeza entre las barras de la oreja con un movimiento lateral mínimo para lograr el cero estereotáxico.

Después de que el animal esté en posición, aplique ungüento lubricante para los ojos para evitar que se seque. Aplique el ungüento una vez más durante la cirugía. Con un bisturí estéril, haga una incisión de dos centímetros en la línea media de la piel a lo largo del cuero cabelludo.

Limpie el área con un aplicador estéril de punta de algodón. A continuación, inserte un retractor de disección para mantener abierto el periostio. Aplique presión firme en el área si se produce sangrado.

Con un aplicador con punta de algodón humedecido en peróxido de hidrógeno al 1%, limpie los tejidos blandos que cubren el cráneo hasta que las suturas bgma y lambda sean visibles. El aspecto más difícil de la cirugía estereotáxica es la posición precisa de la cabeza del animal en el marco estereotáxico. Para marcar coordenadas estereotáxicas precisas en el cráneo de los animales, utilice un atlas cerebral envolvente para determinar las coordenadas estereotáxicas precisas utilizando el bgma B como referencia en este estudio, el trasplante de células madre se realiza en cuatro sitios distintos utilizando las siguientes coordenadas estereotáxicas para marcar las ubicaciones en el cráneo, primero, identificar el bgma.

Siguiente cero. Las tres coordenadas en el controlador de pantalla digital. Una vez puesta a cero, utilice las coordenadas predeterminadas para localizar los sitios de trasplante y hacer una marca con un marcador de punto fino unido a un soporte de sonda en el marco.

Usa un taladro para hacer agujeros de 0,35 milímetros a través del cráneo en cada lugar marcado. Tenga cuidado de evitar daños en la membrana de Durham. Si se produce sangrado durante la perforación, aplique una presión firme con un aplicador con punta de algodón.

El animal ya está listo para el trasplante. Las células madre neurales humanas utilizadas para el trasplante deben prepararse con anticipación y mantenerse en hielo hasta que se necesiten. Cuando esté listo, llene una micro jeringa Hamilton de calibre 30 de cinco microlitros con la suspensión de celdas.

Conecte la jeringa llena a un pequeño soporte de sonda en el marco estereotáxico. Una vez colocado en la posición correcta, inserte con cuidado la punta de la aguja en el orificio del cráneo hasta que llegue a la superficie del cerebro. Ponga a cero la coordenada DV en el controlador de pantalla digital y luego inserte suavemente la aguja a la profundidad deseada.

Mantenga la aguja en su lugar durante un minuto. Después de este tiempo, inyecte las células a una velocidad de 0,25 microlitros por minuto para un total de un microlitro. Mantenga la aguja en su lugar durante ocho minutos antes de retraerla para evitar el reflujo capilar del contenido de la inyección a través de la pista de la aguja, retraiga lentamente la aguja del sitio de trasplante a una velocidad de 0,5 milímetros por minuto.

Repita este procedimiento para los sitios de trasplante restantes. Cuando se completen las inyecciones, retire el retractor de piel y use pinzas romas para tirar suavemente de la piel sobre el cráneo. Cierre la herida con la aplicación de cuatro a cinco pinzas estériles de acero inoxidable después de la cirugía.

Coloque al animal en una jaula climatizada y controle su recuperación. Un mes después del trasplante, las muestras de cerebro se seccionaron y se tiñeron con BRDU para detectar NSCS trasplantado y contrarrestar la tinción con hematina. La trayectoria de la aguja representada aquí por la línea roja indica la trayectoria de la inyección que depositó el NSCS en el sitio de liberación del trasplante designado como TR como visto.

Aquí, el NSCS trasplantado mostró una migración extensa desde las regiones del cuerpo del cuerpo y CA uno al giro dente y ca tres regiones del hipocampo. Es importante que el conjunto de imágenes Mr.I adquirido se utilice con precisión para un conjunto de imágenes CT correspondiente. La fusión adecuada de imágenes es fundamental para la identificación y el posterior contorno de las regiones del hipocampo antes del procedimiento de tratamiento, adquisición de imágenes de rayos X ortogonales para garantizar que el animal esté posicionado con precisión Para garantizar el éxito del trasplante, mantiene un entorno quirúrgico estéril en todo momento.

Mark Otax coordina con precisión y retire la micro jeringa después de la inyección gradualmente para evitar el reflujo de líquidos. Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo realizar un procedimiento de radiación clínicamente relevante utilizando un modelo animal de su elección y cómo trasplantar quirúrgicamente células madre a una región precisa del cerebro.