在自觉的，奔放的小鼠正常血糖高胰岛素 - 夹钳

以下实验的总体目标是在不处理有意识的无应激小鼠中评估全身和组织特异性胰岛素的作用。这是通过手术将一根导管植入颈静脉进行输注，并在颈动脉中植入另一根导管以获取血液样本来实现的。经过 5 到 7 天的恢复期后，将禁食 5 小时的小鼠输注胰岛素以实现生理性高胰岛素血症。

然后从动脉导管测量葡萄糖水平，并通过调整葡萄糖输注速率来维持 U 血糖。该实验允许根据维持 U 血糖所需的葡萄糖输注速率与胰岛素作用之间的直接关系来测量全身胰岛素敏感性的差异。与现有的血液采样方法（如切开尾巴）相比，这种技术的主要优点是，通过手术植入的动脉导管为我们提供了进入小鼠的血管通道，因此我们无需处理鼠标即可获取血液样本。

因此，这使我们能够在无压力和无约束的小鼠身上进行这些实验。动脉导管是通过将一根斜面的 PE 10 管插入一根 6 厘米长的辅助管中制成的，这样 PE 10 就会从sel 伸出 0.9 厘米。静脉导管是一根有领的 6 厘米长的 SEL 管。

该 masa 的构造是将 3 厘米长的 PE 20 插入两个 1.3 厘米 25 号不锈钢连接器 Ben 中，以大约 120 度角插入每个连接器中。这些入到一团医用硅胶粘合剂中，如图所示 要开始导管植入，请使用无菌技术将麻醉的鼠标放在干净的工作台面上。在中线右侧 5 毫米处切开一个切口。

分离右颈静脉。小心地结扎头部，用丝线缝合，然后在尾端松散地系上另一根缝合线。接下来，用弹簧剪刀在头颅结扎线正下方切割，并将导管向上插入约束珠。

在珠子后面系上缝合线，并通过将导管的自由端连接到采样注射器来确认导管取样。要放置动脉导管，请在胸骨左侧和第一个切口的头部 5 毫米处做一个小切口。分离左颈动脉，然后结扎头动脉。

末端用丝缝合线和松散的结。另一根缝合线位于暴露血管的因果端。接下来夹住容器的 codal 端。

然后用弹簧剪刀在结扎的末端下方剪下。小心地将导管插入到夹子上。小心地松开夹子并将导管推进到 Astic P 连接处。

结扎线牢固地系在导管上，并通过将导管的自由端连接到采样注射器来确认导管采样。接下来，将动物翻转过来，在肩胛骨隧道之间做一个小切口，一根 14 号针从前面的切口到后面的切口在皮肤下。将导管穿过针头，使其在小鼠后部外部

将动脉导管和静脉导管连接到鼠标天线上的相应连接器，以便进行采样或检测。接下来，将 masa 插入肩胛骨之间的切口中。用尼龙缝合线闭合两个切口。

确认两个导管的通畅性。将鼠标放在温暖、干净的笼子中进行恢复，并在胰岛素夹之前让鼠标恢复至少五天。在小鼠中进行高胰岛素 U 血糖钳夹最困难的步骤是尝试维持 U 血糖。

小鼠的新陈代谢非常迅速，它们的葡萄糖水平在实验过程中会发生明显变化。这需要一些练习来了解小鼠的血糖水平在整个实验过程中将如何变化，然后如何调整葡萄糖输注速率以保持 U 血糖。标准夹具的设置如下所示。

将 3 次输注 8、葡萄糖胰岛素和洗涤的红细胞连接到一个四向连接器上，该连接器连接到旋转接头并悬浮在鼠标上方。旋转接头的输液口连接到静脉导管。在连接鼠标之前，用盐水填充所有 infuse 8 行。

接下来，用肝素化盐水填充采样线。将带有肝素化盐水的注射器连接到旋转清洁注射器的顶部。在夹子开始前 5 到 6 小时开始禁食小鼠。

研究 3 小时后，对小鼠进行快速称重，并将静脉导管和动脉导管分别连接到输液管线和采样管线。在夹子开始前 15 分钟，将空白葡萄糖滴注插入手持式血糖仪中。接下来，将大约 50 微升血液吸入透明注射器中，以去除管线上的任何盐水并拆下透明注射器。

通过将葡萄糖试纸接触管末端形成的血滴来测量血糖水平。接下来，将带有钝针的注射器插入采样管线并抽取 50 微升血液。将血液分配到 EDTA 涂层管中并离心管以收集血浆以测量基础激素和代谢物。

此时，重新插入透明注射器并拉起柱塞。要去除气泡，请重新注入最初抽取的 50 微升血液。记下血糖仪上的血糖值。

10 分钟后，使用血糖仪和透明注射器重复血糖测量，然后再抽取 50 微升血液以获得另一份血浆样本。进行第二次基线测量后，将葡萄糖、胰岛素和盐水洗涤的红细胞的输注管线填充到四向连接器。将四通连接器连接到连接到旋转输液口的管道。

首先注入盐水洗涤的红细胞。设置输注速率以替换研究期间采样的血液总体积。一旦红细胞输注 8 到达小鼠，开始胰岛素和葡萄糖输注。

这是时间等于零分钟。胰岛素以恒定的预定速率输注。初始葡萄糖输注速率是根据基线血糖水平和既往经验估计的。

在接下来的两个小时内，用血糖仪读取血糖读数并调整葡萄糖输注速率以维持目标 u 血糖 每隔 10 分钟，记录 100 分钟和 120 分钟的新葡萄糖读数和葡萄糖输注速率，收集额外的血液用于测量血浆胰岛素和任何其他激素或代谢物。此处显示的是整个夹闭过程中葡萄糖水平的时间进程，表明在整个夹闭过程中，食物喂养和高脂肪喂养小鼠的 U 血糖维持情况。葡萄糖输注速率的时间进程表明，在高脂肪喂养组中，维持 u 血糖所需的速率显着降低，表明全身胰岛素作用受损。

高脂肪喂养组的空腹和钳夹胰岛素水平也较高，进一步支持胰岛素抵抗表型的存在。在这些小鼠中，氚化葡萄糖用于估计内源性葡萄糖的出现率。Endo A 是肝葡萄糖产生的指数，而胰岛素在对照小鼠中完全抑制 endo A。

在喂食高脂肪饮食的小鼠中抑制受损。同样，TRID 葡萄糖用于估计全身葡萄糖消失的速度。Rd 胰岛素刺激 RD 的能力在喂食高脂肪饮食的小鼠中受损。

两种含有碳 14 的脱氧葡萄糖用于评估葡萄糖代谢指数 RG，一种衡量组织特异性葡萄糖摄取的指标。从这个例子中可以看出，胰岛素刺激的葡萄糖摄取到骨骼肌中，在喂食高脂肪饮食的小鼠中受损。一般来说，刚接触这种方法的人会难以进行植入动脉和静脉导管所需的显微外科手术。

手术需要非常专业的技能，需要几个月的不断练习才能非常熟练地进行高胰岛素 U 血糖钳夹手术，困难再次是尝试在代谢非常高的动物模型中维持 U 血糖。