ヒト細胞培養のための回転細胞培養システム：モデルとしてのヒト栄養膜細胞

この手順では、三次元細胞培養システムを使用して、in vivo細胞動態を模倣します。まず、コラーゲンENCコーティングビーズで細胞をインキュベートします。次に、細胞とビーズを回転する細胞培養システムにロードし、低せん断、低乱流環境で3D細胞凝集

最後に、ダウンストリームアプリケーションで使用するために細胞を回収し、一般的な単層で増殖した細胞の遺伝子発現や細胞分化と比較します。得られた3D培養物は、そのシーンによく似た細胞動態と挙動を示しています。生体内で。

私たちはRCCSを使用して、さまざまなヒト上皮組織の生物学的に意味のある3Dモデルをエンジニアリングしました。私の共同研究者であるシドニー・モリス博士の研究室の元大学院生であるジェシカ・ワーナー博士は、50ミリリットルのコニカルチューブオートクレーブで、12ミリリットルのマイクロキャリア250ミリグラムの細胞デックス3ビーズで、EVT細胞を用いてこの手順を実演します。DPBSは、調製されたビーズを膨潤させ、室温まで冷却することを可能にします。

その後、無菌条件下で、総容量を12.5ミリリットルにします。DPBSを使用すると、余分な絨毛栄養膜細胞の80%コンフルエント培養が回収されます。トリプシン消化を使用して、準備されたサイトデックスを3つのビーズに穏やかに混合し、幅の広い先端10ミリリットルの血清ピペットを使用して、2.5ミリリットルを15ミリリットルの円錐管に移します。

cyto dexの後、3つのビーズがチューブの底に落ち着きます。DPBSの最上層をピペッティングで取り除き、cyto Dex three beadsを乱さないようにします。EVT細胞をcyto Dexの3つのビーズと混合します。

室温で30分間インキュベートし、定期的に混合し、続いて細胞培養インキュベーターで30分間インキュベートし、時々混合します。10 mLのRCCSを滅菌済みの6ウェル培養プレートに入れ、大きなストッパーを取り外してください。次に、温めたGTSFを2つの培地に加え、セルビーズ混合物の総量を10ミリリットルにし、大きなポートを介してRCCSにロードします。

大きなポートストッパーを交換し、小さなポートを閉じます。次の位置で、3ミリリットルの注射器を2つの小さなポートに空にします。各シリンジにメディアを追加します。

2つのバルブをゆっくりと開き、シリンジピストンを交換します。すべての気泡が内部チャンバーから排出されるまで、1つのシリンジからメディアを静かに追加します。RCCSを手に取り、回転させながら側面を軽くたたいて、気泡がないか確認します。

気泡が小さなポートの下に来るまでRCCSを回転させて、残りの気泡を取り除きます。次に、反対側のシリンジを静かに押し下げて、泡をポートに押し込み、チャンバーから押し出します。一方のサイドポートを閉じ続け、もう一方のシリンジピストンを静かに押し下げて容器に少量の正圧を導入し、圧力をかけながら2番目のバルブを閉じます。

最後に、RCCSをローターにロードします。細胞培養インキュベーターで19 RPMで回転を開始し、最適な培養条件を実現します。最初の 3 日間は 1 日おきに、その後は毎日メディアを補充します。

まず、ローターをオフにし、RCCSを取り外します。ピストンを引き上げて吸引力を作ります。各小さなポートからシリンジを取り外し、RCCSを斜めに置き、ビーズが大きなポートの反対側に落ち着くようにします。

次に、小さなバルブの1つを開いて、ビーズを乱すことなく、RCCSからメディアの3分の2を廃棄物コンテナに放出します。小さなバルブを閉じてから、大きなポートを開きます。RCCSに培地を追加し、ストッパーを交換し、前に示したようにすべての気泡を排出し、培養物をインキュベーター内のローテーターに配置します。

凝集体が成長し始めたら、回転速度を目に見えて上げて、細胞が懸濁状態のままになるようにします。細胞を収穫するため。RCCSをローターから外します。

各小さなポートからシリンジを捨て、RCCSをビーズが大きなポートの反対側に向ける角度に置きます。ビーズがすべて落ち着いたら、小さなバルブの1つを開き、メディアの3分の1を廃棄物容器に排出します。小さなバルブを閉じて、大きなポートを開きます。

容器を静かに渦巻かせて凝集体を溶液に分散させ、細胞を滅菌済みの50ミリリットルの円錐管に移します。収集した凝集体を円錐管に沈殿させた後、上清を使用して培養容器を再度十分に洗浄し、凝集体の回収率を最大化します。ワイドボアピペットチップを使用して、下流の機能アッセイのために凝集体をすぐに分注します。

S-G-H-P-L 4つの栄養膜細胞株は、余分な絨毛栄養膜様細胞の一例です。Cyto X 3上のRCCSで増殖した典型的な凝集体では、多くのビーズが増殖する細胞で完全に覆われています。メイン クラスターから離れて伸び、隣接するクラスターにアタッチされているプロジェクションに注意してください。

RCCSから取り出され、細胞外マトリックスに播種されると、EVTのような3D成長細胞は積極的に侵入および/または移動します。実際、R-T-P-C-Rのデータは、従来の細胞培養単層とは対照的に、3D凝集体で見られるMMPの発現の増加を確認しています。興味深いことに、浸潤に関連しない遺伝子もRCCSでアップレギュレーションされています。

このビデオを見れば、細胞株の初代細胞や幹細胞にRCCSを使用して、in vivoでの細胞動態をより忠実に模倣した3次元細胞培養を得る方法について明確に理解できるはずです。