Name: Revelando Topografia Circuito Neural em Multi-Color (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-11-14T12:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 11 s
Description: Aprenda a mapear circuitos neurais em 3D usando traçadores WGA-Alexa em camundongos. Este protocolo permite visualizar projeções topográficas no cerebelo, córtex e medula com alta resolução e transporte rápido bidirecional.

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Este trabalho foi financiado pelo investigador novas start-up fundos de Albert Einstein College of Medicine da Yeshiva University de RVS.

<ol><li>Apps, R., Hawkes, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cerebellar+cortical+organization%3A+a+one-map+hypothesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Cerebellar cortical organization: a one-map hypothesis.</a> Nat. Rev. Neurosci. 10, 670-681 (2009).</li>
<li>Grishkat, H. L., Eisenman, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+the+spinocerebellar+projection+in+the+prenatal+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Development of the spinocerebellar projection in the prenatal mouse.</a> J. Comp. Neurol. 363, 93-108 (1995).</li>
<li>Mesulam, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMesulam%2C+M+%22Tracing+neural+connections+with+horseradish+peroxidase%22">Tracing neural connections with horseradish peroxidase</a>. , Wiley. New York. (1982).</li>
<li>Reeber, S. L., Sillitoe, R. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patterned+expression+of+a+cocaine-+and+amphetamine+regulated+transcript+%28CART%29+peptide+reveals+complex+circuit+topography+in+the+rodent+cerebellar+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Comparative+Neurology%22%5BJournal%5D)">Patterned expression of a cocaine- and amphetamine regulated transcript (CART) peptide reveals complex circuit topography in the rodent cerebellar cortex.</a> Journal of Comparative Neurology. , (2011).</li>
<li>Reeber, S. L., Gebre, S. A., Sillitoe, R. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+mapping+of+afferent+topography+in+three+dimensions%5BTitle%5D)+AND+%22Brain.+Struct.+Funct%22%5BJournal%5D)">Fluorescence mapping of afferent topography in three dimensions.</a> Brain. Struct. Funct. , (2011).</li>
<li>Sillitoe, R. V., Stephen, D., Lao, Z., Joyner, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engrailed+homeobox+genes+determine+the+organization+of+Purkinje+cell+sagittal+stripe+gene+expression+in+the+adult+cerebellum%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Engrailed homeobox genes determine the organization of Purkinje cell sagittal stripe gene expression in the adult cerebellum.</a> J. Neurosci. 28, 12150-12162 (2008).</li>
<li>Sillitoe, R. V., Vogel, M. W., Joyner, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engrailed+homeobox+genes+regulate+establishment+of+the+cerebellar+afferent+circuit+map%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Engrailed homeobox genes regulate establishment of the cerebellar afferent circuit map.</a> J. Neurosci. 30, 10015-10024 (2010).</li>
<li>Vig, J., Goldowitz, D., Steindler, D. A., Eisenman, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Compartmentation+of+the+reeler+cerebellum%3A+segregation+and+overlap+of+spinocerebellar+and+secondary+vestibulocerebellar+fibers+and+their+target+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Compartmentation of the reeler cerebellum: segregation and overlap of spinocerebellar and secondary vestibulocerebellar fibers and their target cells.</a> Neuroscience. 130, 735-744 (2005).</li>
<li>Vogel, M. W., Prittie, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Topographic+spinocerebellar+mossy+fiber+projections+are+maintained+in+the+lurcher+mutant%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Topographic spinocerebellar mossy fiber projections are maintained in the lurcher mutant.</a> J. Comp. Neurol. 343, 341-351 (1994).</li>
<li>Voogd, J., Broere, G., van Rossum, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+medio-lateral+distribution+of+the+spinocerebellar+projection+in+the+anterior+lobe+and+the+simple+lobule+in+the+cat+and+a+comparison+with+some+other+afferent+fibre+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Psychiatr.+Neurol.+Neurochir%22%5BJournal%5D)">The medio-lateral distribution of the spinocerebellar projection in the anterior lobe and the simple lobule in the cat and a comparison with some other afferent fibre systems.</a> Psychiatr. Neurol. Neurochir. 72, 137-151 (1969).</li>
<li>Wu, H. S., Sugihara, I., Shinoda, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Projection+patterns+of+single+mossy+fibers+originating+from+the+lateral+reticular+nucleus+in+the+rat+cerebellar+cortex+and+nuclei%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Projection patterns of single mossy fibers originating from the lateral reticular nucleus in the rat cerebellar cortex and nuclei.</a> J. Comp. Neurol. 411, 97-118 (1999).</li>
</ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

Nós descrevemos os detalhes cirúrgicos e técnicos necessários para o sucesso rastreamento axonal e dendrite usando uma abordagem baseada em romance fluorescentes para rapidamente rotulagem projeções neurais no desenvolvimento e camundongos adultos. Utilizando-WGA Alexa mostramos como traçadores e marcadores podem ser usados ​​para analisar padrões topografia de circuito em alta resolução e em três dimensões. Traçadores muitos estão disponíveis para rastrear circuitos neuronais incluindo cóle...

<table border="1"><tbody><tr><td> Equipamento / reagentes </td><td> Modelo / número Catálogo </td><td> Companhia </td></tr><tr><td> Bead esterilizador </td><td> Modelo Steri 250 Cat. # 18000-45 </td><td> Multa Ferramentas Ciência </td></tr><tr><td> Cauterizador </td><td> Gato. # 18000-00 </td><td> Multa Ferramentas Ciência </td></tr><tr><td> Vidro borosilicato capilares </td><td> Gato. # 300056 </td><td> Harvard Apparatus </td></tr><tr><td> Vidro duplo estágio Micropipeta Puller </td><td> Modelo PC-001-10 </td><td> Narishige </td></tr><tr><td> Seringa micrométrica </td><td> Gato. # GS-1100 </td><td> Gilmont Instruments </td></tr><tr><td> Instrumento estereotáxica Pequenos Animais </td><td> Modelo 940-A </td><td> Instrumentação Kopf </td></tr><tr><td> Manipulator eletrodo </td><td> Modelo 960 </td><td> Instrumentação Kopf </td></tr><tr><td> Vetcare câmara </td><td> Gato. #340508 </td><td> Harvard Apparatus </td></tr><tr><td> Almofada de aquecimento </td><td> Gato. # 341241 </td><td> Harvard Apparatus </td></tr><tr><td> Leica DFC360 FX câmera </td><td> DFC360 FX </td><td> Leica </td></tr><tr><td> Leica câmera DFC490 </td><td> DFC490 </td><td> Leica </td></tr><tr><td> Leica DM5500 microscópio </td><td> DM5500 </td><td> Leica </td></tr><tr><td> Leica DFC3000 FX câmera </td><td> DFC3000 FX </td><td> Leica </td></tr><tr><td> Leica MZ16 FA microscópio </td><td> MZ16 FA </td><td> Leica </td></tr><tr><td> Cy3 Filtro </td><td> Modelo # 11600231 </td><td> Leica </td></tr><tr><td> FITC Filtro </td><td> Modelo # 11513880 </td><td> Leica </td></tr><tr><td> A4 DAPI / filtro UV </td><td> Modelo # 11504162 </td><td> Leica </td></tr><tr><td> Aglutinina de gérmen de trigo, Alexa Fluor 488 conjugado </td><td> Gato. # W11261 </td><td> Invitrogen </td></tr><tr><td> Trigo germ aglutinina, Alexa Fluor 555 conjugado </td><td> Gato. # W32464 </td><td> Invitrogen </td></tr></tbody></table>

revelando topografia circuito neural em multi-color

Revealing Neural Circuit Topography in Multi-Color

Circuitos neurais funcionais estão organizados em mapas topográficos. Para visualizar a arquitetura circuito complexo que nós desenvolvemos uma abordagem para a fiabilidade rótulo o padrão global de múltiplas projeções topográficos. O cerebelo é um modelo ideal para estudar o arranjo ordenado dos circuitos neurais. Por exemplo, a organização compartimental de espinocerebelar fibras musgosas provou ser um sistema indispensável para o estudo de padronização de fibras musgosas. Recentemente, mostrou que aglutinina de gérmen de trigo (WGA), conjugada com Alexa 555 e 488 podem ser usados ​​para rastreamento espinocerebelar projeções de fibras musgosas no desenvolvimento e camundongos adultos (Reeber et al. 2011). Encontramos três principais propriedades que tornam as ferramentas WGA-Alexa traçadores desejável para rotulagem projeções neural. Primeiro, fluoróforos Alexa são intensas e seu brilho permite imagens wholemount diretamente após rastreamento. Segundo, WGA-Alexa traçadores rótulo toda a trajetória de desenvolvimento neural e adultos Projections. Terceiro, WGA-Alexa traçadores são rapidamente transportados nas direções retrógrada e anterógrada. Aqui, descrevemos em detalhes como preparar os marcadores e outras ferramentas necessárias, como executar a cirurgia para rastreamento espinocerebelar ea melhor forma de projeções de imagem traçada em três dimensões. Em resumo, nós fornecemos um protocolo passo a passo de rastreamento que vai ser útil para decifrar a organização e conectividade de mapas funcionais não só no cerebelo, mas também no córtex, tronco cerebral e medula espinhal.

Nós fornecemos um guia prático para entregar traçadores<em&gt; In vivo</em&gt; E usar a via espinocerebelar como um sistema modelo para demonstrar passos essenciais para a análise do circuito neuronal sucesso em camundongos. Descrevemos em detalhe o nosso protocolo versátil rastreamento que explora aglutinina de gérmen de trigo (WGA), conjugada com fluoróforos Alexa.

Revelando Topografia Circuito Neural em Multi-Color

Os circuitos neurais são organizados em mapas topográficos funcionais. A fim de visualizar a arquitetura complexa dos circuitos, desenvolvemos uma abordagem para ...

Este procedimento descreve um protocolo versátil de rastreamento in vivo que utiliza glutenina de germe de trigo conjugada a fluoróforos Alexa para rastrear circuitos neuronais. Primeiro, é feita uma incisão na região torácica inferior e na região lombar superior, e a fáscia e os músculos espinhais superficiais são cortados. O segundo passo consiste em realizar uma laminectomia dorsal.Em seguida, o microeletrodo é preparado e fixado ao micromanipulador. Depois, realiza-se a injeção por pressão de traçadores neurais na medula espinhal. O passo final deste procedimento é fornecer os devidos cuidados pós-cirúrgicos durante a recuperação e garantir tempo suficiente para que os traçadores sejam transportados por todo o trajeto alvo.Por fim, podem ser obtidos resultados que mostram a organização e conectividade de mapas topográficos no córtex cerebelar, tronco encefálico e medula espinhal por meio de microscopia de imunofluorescência. A principal vantagem deste traçador em relação a traçadores existentes, como BDA ou W-G-A-H-R-P, é que os traçadores WGA Alexa são suficientemente brilhantes para permitir a imagem em montagem total diretamente após o rastreamento. Este método pode ajudar a

revealing-neural-circuit-topography-in-multi-color

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociência

A questão fundamental em nossa compreensão do circuito cortical é como as redes em diferentes camadas corticais codificar a informação sensorial. Aqui, descrevemos técnicas eletrofisiológicas utilizando eletrodos de contato multi-laminar para gravar um único unidades e potenciais de campo locais e análises presentes para identificar camadas cortical.

Examinando Processamento Rede Local usando contato Multi-Gravação Eletrodo Laminar

Este artigo apresenta uma abordagem que combina a fotostimulação com varredura a laser e gravações em célula inteira em camundongos transgênicos que expressam GFP em populações limitadas de neurônios inibitórios. A técnica permite o mapeamento extensivo e a análise quantitativa de circuitos sinápticos locais de neurônios corticais inibitórios específicos.

Mapeamento Inibitória Circuitos Neuronal por Laser Scanning fotoestimulação

Circuitos neurais são topograficamente organizados em compartimentos funcionais específicas com perfis moleculares. Aqui, apresentamos os passos práticos e técnicos para revelar topografia cérebro global usando uma abordagem de coloração imuno-histoquímica wholemount versátil. Nós demonstrar a utilidade do método utilizando o citoarquitetura bem compreendida e os circuitos de cerebelo.

Imuno-histoquímica para Topografia Wholemount cerebrais, Complexo

É descrito um método para a marcação de neurónios com corantes fluorescentes funcionais pré-determinados micro-domínios do neocórtex. Primeiro, a imagem do sinal óptico intrínseco é usado para obter um mapa funcional. Em seguida, dois fotões microscopia é utilizado para marcar e neurónios de imagem dentro de um domínio de micro-do mapa.

Rotulagem alvo de neurônios em um específico domínio funcional de Micro-do neocórtex por Combinando sinal intrínseco e dois fótons de imagem

Este protocolo descreve reconstruções em larga escala de populações neuronais selectivos, marcados após a infecção retrógrada com um vírus da raiva modificado expressando marcadores fluorescentes, e análises independentes cluster, imparcial que permitem a caracterização abrangente de métricas morfológicas entre subclasses neuronais distintas.

Reconstruções em larga escala e, Clustering imparcial independente baseado no morfológicas Métricas para classificar Neurônios no seletivos Populações

Aqui, apresentamos um procedimento para a realização de imagens de Ca 2 + em larga escala com resolução celular em múltiplas camadas corticais em camundongos que se movem livremente. Centenas de células ativas podem ser observadas simultaneamente usando um microscópio em miniatura montado na cabeça acoplado com uma sonda de prisma implantada.

Multi-layer Cortical Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; Imaging em ratos com movimento livre com sondas de prisma e microscopia de fluorescência miniaturizada

Quando integrada com uma placa de cabeça e um design óptico compatível com microscópios de um e dois fótons, a lente de microprisma apresenta uma vantagem significativa na medição de respostas neurais em uma coluna vertical sob diversas condições, incluindo experimentos bem controlados em estados fixos na cabeça ou tarefas comportamentais naturais em animais em movimento livre.

Imagem de Longo Prazo de Populações Neurais Identificadas Usando Microprismas em Animais em Movimento Livre e Cabeça Fixada

As áreas sensoriais primárias no neocórtex exibem atividades espontâneas únicas durante o desenvolvimento. Este artigo descreve como visualizar atividades de neurônios individuais e áreas sensoriais primárias para analisar atividades síncronas específicas de área em camundongos neonatais in vivo.

Visualização in vivo da atividade espontânea no córtex sensorial de camundongos neonatais com resolução de neurônio único

Aqui, empregamos HD-MEA para nos aprofundarmos na dinâmica computacional de conjuntos neuronais de grande escala, particularmente em hipocampo, circuitos de bulbos olfativos e redes neuronais humanas. A captura da atividade espaço-temporal, combinada com ferramentas computacionais, fornece insights sobre a complexidade do conjunto neuronal. O método melhora a compreensão das funções cerebrais, potencialmente identificando biomarcadores e tratamentos para distúrbios neurológicos.

Gravação e Análise da Dinâmica Multimodal de Conjuntos Neuronais em Larga Escala em Microeletrodos de Alta Densidade Integrados CMOS

Aqui, apresentamos dois protocolos para registro de microeletrocorticografia de alta densidade (μEcoG) em ratos e camundongos, incluindo métodos cirúrgicos, de implantação e de registro. As gravações de μECoG são realizadas em combinação com a gravação de politrodo laminar no córtex auditivo de ratos ou com a manipulação optogenética da atividade neural no córtex somatossensorial de camundongos.

Investigações Multiescala de Processamento Cortical Integrando Politrodos Laminares e Optogenética com Microeletrocorticografia em Roedores

Aprenda a mapear circuitos neurais em 3D usando traçadores WGA-Alexa em camundongos. Este protocolo permite visualizar projeções topográficas no cerebelo, córtex e medula com alta resolução e transporte rápido bidirecional.

Revelando Topografia Circuito Neural em Multi-Color

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