باستخدام علم الوراثة العكسية للتلاعب الجيني NSS لفيروس حمى الوادي المتصدع MP - 12 سلالة لتحسين سلامة وفعالية اللقاحات

يولد هذا الإجراء فيروس حمى الوادي المتصدع المؤتلف MP 12 سلالة تشفر NSS المتحولة عن طريق علم الوراثة العكسي ويهدف إلى توصيف الأنماط الظاهرية لتطوير اللقاح. أولا ، باستخدام نظام التعداء في Bhk T سبع تسع خلايا ، والتي تعبر بثبات عن T سبعة بوليميراز الحمض النووي الريبي تستعيد طفرات سلالة MP 12 المؤتلفة ، ثم تضخيم طفرة سلالة MP 12 المؤتلفة المستردة في خلايا Vero E الست ومعايرة طفرات MP 12 المضخمة عن طريق فحص البلاك. تتمثل الخطوة الأخيرة من الإجراء في فحص نقص إنترفيرون أو ألفا أو بيتا بواسطة بروتينات NS الطافرة.

في النهاية ، يمكن أن تسهل النتائج إعداد لقاح حي موهن مرشح لحمى الوادي المتصدع من خلال نظام علم الوراثة العكسي. الميزة الرئيسية لهذه التقنية على الطريقة الحالية ، مثل إدخال الطفرة بشكل عشوائي في الجينوم الفيروسي باستخدام النيتروجين الكيميائي أو الممر التسلسلي ، هي القدرة على إدخال طفرة في الجينوم الفيروسي باستخدام النظام الجيني. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في معالجة الأسئلة الرئيسية في مجال لقاحات حمى الوادي مثل أهمية العامل الرئيسي NSS في مناعة اللقاحات المرشحة.

بشكل عام ، سيكافح الأفراد الجدد في هذه الطريقة لأن فيروس حمى الماء السريع ، كما هو الحال في شكل الكتل المستهدفة وتصور الكتلة يتطلب تقنية محسنة. يعد العرض المرئي لهذه الطريقة أمرا بالغ الأهمية حيث يصعب تعلم خطوات التعافي الفيروسي والترطيب لأنه لم يتم الإبلاغ عن بروتوكول خطوة بخطوة لهذه الطريقة. باستخدام أطباق بطول ستة سنتيمترات ، ضع T السبع تسعة خلايا كلى للهامستر الصغيرة ، والتي تعبر بثبات عن بوليميراز T سبعة RNA وضع حاضنة عند 70 إلى 80٪ من وسائط تغيير طلاقة الخلية لإكمال MEM alpha بدون hygromycin B. في غضون ساعة ابدأ عملية التعدي للتعافي من فيروس حمى الوادي المتصدع.

قم بإنشاء مجموعة واحدة من البلازميدات التي تشفر الحمض النووي الريبي الجيني الفيروسي للتعبير الكامل عن الحمض النووي الريبي الفيروسي ومجموعة ثانية تشفر الجين الفيروسي افتح إطارات القراءة للتعبير عن البروتين الفيروسي. أضف الآن 30 ميكرولترا من العبور LT واحد إلى 385 ميكرولتر من Optum في أنبوب 1.5 ملليلتر. دوامة لفترة وجيزة واحتضان لمدة خمس دقائق.

في درجة حرارة الغرفة ، أضف الجسيمات الشحمية الناتجة ببطء إلى مجموعات البلازميد 10 ميكروغرام الممزوجة بلطف عن طريق سحب العينة واحتضانها لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة بطريقة قطرة قطرة ، أضف خليط التعداء إلى bhk T سبع تسع خلايا واحتضن لمدة 24 ساعة. استبدل المادة الطفية المزروعة ب MEM alpha الكامل والثقافة لمدة أربعة أيام إضافية. قم بحصاد المواد الطافية المزرعة في أنبوب سعة 50 مليلتر وإزالة بقايا الخلايا عن طريق الطرد المركزي.

الآن Eloqua المواد الطافية في غطاء لولبي خمسة أنابيب تبريد بطول خمسة ملليلتر وتخزين هذا الممر. مخزون فيروس صفر عند 80 درجة مئوية تحت الصفر لتسهيل التجارب النهائية. تضخيم فيروس P صفر في الخلايا التي تفتقر إلى جينات إنترفيرون ألفا وبيتا ينمو 80٪ من التقاء فيرو إي ستة ثقافات في DMEM كامل ، واستبدال الوسط بفيروس P zero المخفف واحتضانه لمدة ساعة.

قم بإزالة العين والثقافة في 10 ملليلتر من DMEM الكامل لمدة ثلاثة إلى أربعة أيام حتى يصبح تأثير الاعتلال الخلوي ل Vero E ست خلايا واضحا. احصد المادة الطافية كما هو موضح سابقا وقم بتعيين العينات على أنها E ستة P واحدة باستخدام ست ألواح آبار تنمو Vero E ست خلايا إلى 80٪ من الطلاقة المشتركة في DMEM الكامل. استنشق الوسط من خلايا Vero E الست وأضف 400 ميكرولتر من التخفيفات التسلسلية عشرة أضعاف من E ستة P واحد احتضان مستحضر الفيروس لمدة ساعة.

في هذه الأثناء ، قم بإعداد أنبوبين سعة 15 مليلتر لأنبوب تراكب الأجار. يحتوي A على سبعة ملليلتر من 1.2٪ أجار نبيل في الماء واثنين من B يحتويان على سبعة ملليلتر من مرق فوسفات بجرعة كاملة من 10٪ بعد 15 دقيقة في حمامات المياه ، يصب الأنبوب B في الأنبوب A ويستخدم ماصة لخلطها معا. استبدل العين الفيروسية بملليلترين لكل بئر من خليط واحد لواحد من الأنبوبين A و B.استمر في زراعة الخلايا لمدة ثلاثة إلى أربعة أيام.

قم بإعداد تراكب المثقاب عن طريق إضافة 1.2٪ أجار نبيل اثنين × MEM كامل وأحمر محايد إلى الأنبوب A إلى B وأنبوب ثالث يسمى أنبوب وضع أحمر محايد A في حمام مائي 42 درجة مئوية والأنبوبين الآخران في حمام مائي 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة. ثم امزج معا سبعة ملليلتر من الأنبوب A وسبعة ملليلتر من الأنبوب B و 0.5 مل من الكمية الحمراء المحايدة ملليلترين من الخليط في كل بئر من ستة ألواح جيدة واحتضان اللوحة طوال الليل. حدد الآن عدد وحدات المنصات لكل مليلتر C 57 الخلايا الليفية الجنينية من النوع البري للفأر تشفر جين الفوسفاتيز القلوي الجنيني المفرز الذي يحفزه NF kappa B و IRF ثلاثة أو سبعة.

نقوم هنا بفحص نشاط التسرب الناجم عن الاستجابات المناعية الفطرية التي تصيب الخلايا الفرعية المتزامنة في 12 لوحة بئر إما مع MP 12 المؤتلف الذي يشفر طفرات NS أو MP 12 التحكم وتحتضنه لمدة ساعة واحدة. قم بإزالة العين وأضف ملليلتر واحد لكل بئر من DMEM الكامل والمزرعة لمدة 14 ساعة. حصاد المواد الطافية للثقافة لفحص التسرب لكل بئر من صفيحة 96 بئر ، أضف 200 ميكرولتر من اللون الأزرق الكمومي وأضف 50 ميكرولترا من كل ختم عينة واحتضان اللوحة عند 37 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة.

قم بقياس OD عند 650 نانومتر باستخدام قارئ لوحة. يحتوي فيروس حمى الوادي المتصدع على جينوم الحمض النووي الريبي ذو المعنى السلبي الثلاثي يسمى SM و L الجزء مقارنة ب NSS لسلالة MP 12. يتم اقتطاع إطار القراءة المفتوح من النوع C 13 بنسبة 69٪ عادة ، يولد النظام الجيني العكسي فيروسات MP 12 مؤتلفة قابلة للحياة مع عيار أعلى من واحد في 10 إلى ستة PFU لكل مليلتر فيروس من النوع C 13.

تشكل وظائف N التي تفتقر إلى لويحات توريدية كبيرة بينما شكل MP 12 لويحات شفافة بأحجام مختلفة مقارنة بالخلايا المصابة الوهمية في 14 ساعة. بعد العدوى. C 57 خلايا الميثامفيتامين البرية المصابة ب MP 12 لا تزيد من مستوى التسرب في المزرعة.

على النقيض من ذلك ، تؤدي العدوى من النوع C 13 إلى زيادة مستوى التسرب بمقدار 14 ساعة بعد الإصابة ، تؤكد البقع الشمالية باستخدام مسبار الحمض النووي الريبي الخاص بالفأر ISG 56 mRNA أن التنظيم الإضافي ل ISG 56 mRNA في غياب تعبير N'S. يمكن أن يؤدي اتباع هذا الإجراء كطريقة مثل تحصين الفئران واختبار تحييد الجسم المضاد إلى استجواب أسئلة مثل مناعة متحولة NSS. مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال حمى الوادي لاستكشاف وظائف الجينات غير الهيكلية في الخلايا المصابة.

لا تنس أن العمل مع الفيروسات المعدية يمكن أن يكون خطيرا للغاية ، لذا اتخذ دائما الاحتياطات اللازمة لتجنبها. استنشاق AOLs. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية استعادة ومعايرة سلالات MP 12 المؤتلفة وكيفية فحص طفرات NSS التي تفتقر إلى وظيفة قمع الإنترفيرون ألفا بيتا.