ניתוח של עמדת מחזור התא בתאי יונקים

מטרת הליך זה היא להיות מסוגל לקבוע את שיעור התאים בשלבים השונים של מחזור התא. זה מושג על ידי הוספת ריאגנט תיוג התפשטות התאים BRDU לתרבית תאים בת קיימא לשילוב בכתם הבא של ה-DNA שסונתז לאחרונה, ה-BRDU בתאים ששילבו את הריאגנטים, ואז ה-DNA נצבע בפרופידיום יודיד. השלב האחרון הוא להעריך את שיעור התאים בשלבים השונים של מחזור התא על ידי ציטומטריית זרימה.

בסופו של דבר ניתן לדמיין את התפלגות מחזור התא של אוכלוסיית תאי ניסוי באמצעות ניתוח זרימה ציטומטרי של תאים המסומנים ב-BRDU. היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות כמו שילוב טרימין לטימין וספירת נצנוצים הוא שבעזרת תיוג BRD, ניתן לקבוע את שיעור התאים בכל שלב במחזור התא. הדגמה חזותית של מסר זה היא קריטית מכיוון שקשה להסביר את ערכת הניתוח הציטומטרי העמיתה ללא תמונות נלוות של הפרמטרים השונים שיש להתאים.

ידגימו את ההליך שני סטודנטים לתארים מתקדמים מהמעבדה שלי, מאט צ'י ואני מירי. הוסף BRDU בדילול של 1 עד 1000 לתרביות התאים הניסיוניות דגירה למשך שעה אחת כדי לקצור את התאים, לשאוב את מדיום התרבית, ולאחר מכן לשטוף את התאים ביסודיות עם PBS פעמיים כדי להסיר את כל עקבות המדיום. הפעם באמצעות PBS בתוספת 3 מילי-מולרי EDTA, שטפו את התרביות במהירות פעם נוספת, ולאחר מכן שאפו היטב את תמיסת P-B-S-E-D-T-A כדי לנתק את התאים.

מוסיפים כ-0.5 מיליליטר P-B-S-E-D-T-A לכל צלחת תרבית של שישה סנטימטרים ומדגרים את הכלים בחום של 22 מעלות צלזיוס למשך כחמש דקות. לאחר מכן העבירו את תרביות התאים מכל צלחת לצינורות חרוטיים בודדים של 15 מיליליטר. כעת צנטריפוגה של התאים בכוח הכבידה פי 500 למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר ואז הסר את הסופינט, ואז השהה מחדש את התאים ב-100 מיקרוליטר של PBS.

לבסוף, תקן את התאים על ידי הוספת חמישה מיליליטר של אתנול 95% טיפה תוך מערבולת צנטריפוזיה של התאים בכוח הכבידה פי 500 למשך חמש דקות של טמפרטורת החדר. שוב, הסר את האתנול והשהה מחדש את הגלולה במיליליטר אחד של שני HCL רגילים המכילים 0.5% טריטון X 100 על ידי הוספת התמיסה לתאים בצורה טיפתית תוך כדי מערבולת ואז דגירה על התאים בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות. לאחר הגלולה התאים שואפים שוב את הסופרנטנט S תוך זהירות מיוחדת מכיוון שהתאים יוצרים כדור רופף מאוד בשלב זה.

לאחר מכן השעו בעדינות את הגלולה במיליליטר אחד של 0.1 קצב קידוח נתרן טטרה מולארי ודגרו שוב על התאים. כעת גלולה את התאים פעם נוספת והפעם דגרה אותם ב-0.5 מיליליטר של תמיסת נוגדנים המכילה נוגדנים נגד BRDU של עכברים מדוללים מ-1 ל-50 לאחר גלולת התאים שוב. השעו את הכדור הזה ב-50 מיקרוליטר של תמיסת נוגדנים המכילה נוגדנים משניים מצומדים נגד US ZI, מדולל אחד עד 25.

לאחר מכן דגרו את התאים בחושך למשך 30 דקות של טמפרטורת החדר. לאחר צנטריפוגה של התאים בפעם הסופית, דגרו אותם ב-0.5 מיליליטר של תמיסת יודיד פרופידיום ו-RNA בחושך בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות. לבסוף, העבירו את תמיסת התאים המעוכלת דרך מסננת תאים כדי להסיר אגרגטים.

לאחר מכן העבירו את התאים הבודדים לצינור מתאים לספיגת דגימה על ציטומטר הזרימה לאוכלוסיות תאים המתפשטות באופן אסינכרוני כמו זו המוצגת. בדוגמה זו, מקם שער סביב שתי הפסגות הנפוצות ביותר בתרשים ההבחנה הכפולה כדי לבחור אירועי תא בודד עבור כל הניתוחים הבאים. לאחר מכן נתח דגימת תרבית מתפשטת באופן אסינכרוני כדי לשמש כבקרה חיובית להגדרת פרמטר ציטומטר צביעה וזרימה.

התאם את הרגישות של צינור מכפיל הפוטו לצביעה של פרופידיום יודיד כך ששתי פסגות ה-N וארבע ה-N מהתאים הבודדים מרוכזות ביחידות השרירותיות של 200 ו-400 על ציר ה-x. לאחר מכן, התאם את הרגישות של צינור מכפיל התמונות המזהה FXI כך שתאים שליליים של FXI יהיו מעל רמות הרקע. תאים חיוביים ל-BRDU צריכים להיות בהירים פי 10 בערך וציר ה-x צריך להיות מוצג כסולם לוגריתמי.

האירועים הבודדים שנלכדים על ידי ציטומטר הזרימה יוצרים קשת בצורת פרסה משלב G אחד בפינה השמאלית התחתונה עד לשלב S ואז חזרה למטה לפינה הימנית התחתונה עבור שלב G two M. כפי שניתן לראות באיור מייצג זה, אסוף 5,000 עד 10,000 אירועי תא בודד כדי להשיג את הטווח הרצוי של תכולת ה-DNA. לאחר מדידת תכולת יודיד פרופידיום ותכולת BRDU, הקצה את התאים לשלב G אחד s או G שני קמ"ש עם שערים סביב שתי האוכלוסיות השליליות של BRDU הממורכזות ב -200 עבור G אחד ו -400 עבור G שני M. כלול את כל האירועים מעל שתי התיבות הללו בשער יחיד למדידת שלב S, אחוז התאים בכל שער ייצג את המספר היחסי של תאים בשלבים G one s ו- G two M כפי שמוצג כאן בגרף עמודות זה עבור איור תרשים הפיזור הקודם.

לאחר צביעה לסמן תא מעניין בדוגמה זו CD 20 צנטריפוגה את התאים בכוח הכבידה פי 500 למשך 10 דקות ב-22 מעלות צלזיוס, ולאחר מכן השעו מחדש את הגלולה בחמישה מיליליטר PBS בתוספת 1% BSA. לאחר הטלת התאים שוב בכוח הכבידה פי 500 למשך חמש דקות של טמפרטורת החדר, השתמש ב-0.5 מיליליטר של תמיסת הפרופידיום יודיד וה-RNA כדי להחזיר לחות לתאים. לאחר מכן לצבוע ולעכל את התאים כפי שהוצג זה עתה, שער את שתיים וארבע פסגות התא הבודד, ולאחר מכן להתאים את הרגישות של שפופרת מכפיל הפוטו לזיהוי FXI כך שהתאים הלא מוכתמים יהיו מעל רמות הרקע.

באופן אידיאלי, התאים החיוביים CD 20 FXI יהיו מוכתמים בעוצמה גבוהה פי 10 עד 100 מהרקע. שוב, יש להציג את ציר ה-x כסולם בקנה מידה לוגריתמי. לבסוף, בחר את התאים החיוביים CD 20 הבהירים פי 10 מרמות הרקע ועם צביעת פרופידיום יודיד בין 200 ל-400 לתצוגה בהיסטוגרמה של פרופידיום יודיד לעומת ספירת תאים כפי שמוצג כאן באיור מדגם זה, אסוף לפחות 1000 CD 20 אירועים חיוביים עבור כל דגימה כדי להגביל את השונות באיור זה.

מוצג ניתוח ציטומטרי זרימה תלת מימדי של תאי פרופידיום יודיד וכתמי BRDU. שים לב שהתאים עם שניים וארבעה תוכן NDNA מרוכזים על פני 200 ו-400 סימנים בסולם ציר X. עבור עוצמת צביעת פרופידיום יודיד, עוצמת הצביעה של BRDU נמדדת בקנה מידה לוגריתמי.

על ציר ה-Y, שימו לב למיקומי השערים המשמשים לכימות תאים בשלבים G one s ו-G two M של מחזור התא. החלק היחסי של התאים בכל אחד משערי G one s ו- G שני M מהאיור הקודם מוצג כאן. כאן, פרופידיום, יודיד ותקליטור 20.

צביעה מתערובת של תאים, שחלקם מתבטאים באופן אקטופי CD 20 ו-PRB. שימו לב שהתאים עם 2 n ו-4 NDNA, האוכלוסיות הנפוצות ביותר, מרוכזות על פני 200 ו-400 סימנים על ציר ה-x. המיקום של ההליכה החיובית CD 20 בחר תאים המוכתמים לפחות פי 10 יותר בהירים מהרקע.

היסטוגרמה זו מייצגת ספירת תאים לעומת צביעת פרופידיום יודיד עבור תאים שליליים CD 20 מתכלת פיזור קודמת המתפשטים באופן אסינכרוני בהיסטוגרמה זו CD 20 תאים חיוביים מתרשים הפיזור הקודם CD 20 שהושרו לעצור עם ביטוי p rrb ומכילים תאים עם בעיקר שני תכולת NDNA. נתונים אלה מדגימים כי ניתן להבחין בין תת-אוכלוסייה שנעצרה לבין תאים אחרים בתרבית באמצעות טכניקת צביעה זו. בשלושת האיורים הבאים, מוצגים כאן נתונים מניתוח זרימה ציטומטרי של ביטוי רטרו-ויראלי של מעכב הקינאז התלוי בציקלין P 27 KIP one בפיברובלסטים עובריים של עכברים.

Propidium iodide, ניתוח BRDU שימש למדידת שלבי מחזור התא באוכלוסייה אסינכרונית של תאים שהומרו עם וקטור רטרו-ויראלי ריק של P babe כפי שמוצג כאן. מעט אירועים חיוביים של BRDU נראו בשער שלב S בתגובה ל-P 27. שימו לב גם לעוצמה הגדולה יותר של האירועים בשערים G 1 ו-G 2 M.

כמו כן, אחוז התאים בשלב S עבור תאים המבטאים P 27 נמוך למדי כפי שמתואר באיור זה. סוג זה של ניתוח היה יעיל מאוד באפיון ליקויים בבקרת מחזור התא בתאים שמקורם בזנים שונים של עכברים ממוקדי גנים. בשני האיורים הבאים, תאי אפיתל זיכרון לא נוצרים טופלו בציטוקין מעכב גדילה TGF beta one למשך 24 שעות.

כפי שמוצג באיור ראשון זה, תיוג BRDU בתאי שלב S מצטמצם מאוד על ידי איתות TGF beta one. שימו לב להצטברות התאים בעיקר בשלב G אחד של מחזור התא כפי שניתן לראות בפאנל האמצעי. כימות השלבים השונים של מחזור התא מאשר כי TGF beta one מעכב בעיקר התפשטות ב-G שלב אחד של מחזור התא המוביל להצטברות בשלב זה.

בסדרה אחרונה זו של ניתוח ניסיוני, חסר PRB, SAS שני תאים הועברו עם וקטור ביטוי CMV CD 20 ו-CMV RB או CMV beta GAL כבקרה. איור ראשון זה מדגים את התפלגות מחזור התא של תאי הבקרה השלילית בהשוואה להתפלגותם לאחר 72 שעות של ביטוי PRB. שימו לב, הנוכחות הכמעט בלעדית של שיא של שני N בפאנל הימני בהתאמת עקומת הדמות הסופית הזו על ידי תוכנה רב-מחזורית גילתה שהתאים הצטברו בעיקר בשלב G אחד לאחר ביטוי PRB.

בעוד שהאוכלוסיות בשלבים s ו-G 2 M היו מדוללות יחסית. לאחר שליטה, ניתן להתאים טכניקה זו לחקר סמני מחזור תאים אחרים כגון היסטונים זרחניים ב-mph. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לקבוע את התפלגות מחזור התא של אוכלוסיית תאים.

אל תשכח ששני החומצה ההידרוכלורית הרגילה היא קאוסטית ופרופידיום. יודיד הוא מסרטן פוטנציאלי. הם יכולים להיות מסוכנים ב.

תמיד יש לנקוט באמצעי זהירות בעת השימוש בכימיקלים אלה.